Name: Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 배우세요 척추신경절 감각신경원의 격리 배양 기술로 신경돌기 성장과 신경영양인자 신호전달을 연구하세요. 이 방법은 신경과학 실험에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는 도움이 토론 Katharina Cosker과 스테파니 코세인 감사하고 싶습니다.

시약의 준비 <ol><li> 콜라겐 코팅 : 콜라겐 코트 P35 조직 문화 접시 37 오븐에 장소 ° 디바이더를 기름 치는 것 이전 2 일간 C. 콜라겐의 최종 농도는 0.71 MG / 0.001 N HCL에 희석 ML에서해야합니다. 그런 다음, 접시 당 혼합물의 1 ML를 추가합니다. </li><li> 그리스 로더 : 그리스 로더를 작성하기 위해, 60mL 주사기가 처음 코닝 진공 기름으로 가득해야합니다. 45 분 동안 압력솥 후, 그리스 로더를 작성 호일에 포장하고 주사기를 사용합니다. </li><li> 테플론 디바이더 : 디바이더는 각 실험 후 다시 사용할 수 있지만 먼저 제대로 청소해야합니다. 접시에서 분배기를 제거 2 일 황산에 남아있는 기름과 장소를 모두 닦아. 산성에서 제거한 후, 물 3 배, 종기와 린스 20 분, 건조 20 분 유리 p100 페트리 접시와 압력솥의 자리를 수 있습니다. </li><li> N2 - 메틸 셀룰로오스 : 메틸 셀룰로오스의 1.5g을 올리고 돛을 500mL 병에 넣습니다. 저어 표시줄을 추가하고 건조에 20 분 동안 그것을 압력솥 (이 시점에서 모든 작업을 살균해야합니다.) 다음 혈청 무료 미디어 (N 2) 500 MLS를 추가하고, 그것이 해소 때까지 차가운 방에 저어. -20 ° C. 50 ML conicals 및 동결로 나누어지는 -20 ° C.에서 일하는 주식, 1mL 튜브에 50 ML conicals 중 하나 나누어지는 및 동결에 대한 </li><li> DRG 미디어 : DMEM, 5 % 히트 inactivated 말 혈청,, 1 %의 페니실린 스트렙토 마이신. </li><li> 100ng/mL DRGN 미디어 : 모두 신경 성장 인자 (NGF)와 두뇌 파생 neurotrophic 요인 (BDNF)의 주식 농도는 1mg/mL입니다. DRG 미디어에 neurotrophins 1:10,000 각 희석. 문화는 NGF 혼자 재배 수 있으며, 이것이 문화에서 살아남기 뉴런의 보완을 바꿀지도 모르겠어. 참고 : 필요한 경우, (사이 토신 arabinoside) AraC의 농도가 1uM 및 0.3uM의 최종 농도에 사용됩니다. 이것은 Schwann 세포와 다른 glia의 성장을 억제합니다. </li><li> 10ng/mL DRGN 미디어 : DRG 미디어 100ng/mL DRGN 미디어 (1시 10분)을 희석. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="그림 1" width="392" height="294"> 설정에 필요한 그림 1. 도구 </li></ol> (해부하기 전에 1-2일이 과정을 시작합니다) compartmented 회의소 설정 <ol><li> 밖으로 운동과 함께 콜라겐 코팅 P35 접시의 중앙에 흠집을 만듭니다. </li><li> 처음의 중간에 N2 - 메틸 셀룰로오스의 플레이스 30ul. 분할기가 기름칠 때까지 따로 요리를 설정합니다. </li><li> 그리스 로더에 23 게이지 luer 스텁 어댑터를 연결합니다. 그립 테플론 90 ° 각도 hemostats 한 쌍의로 구분선하고 현미경 아래에 직면하고있는 분할기와 함께 그것이 평평하다. 그리스는 그리스의 연속 라인 (그림 참조)가 너무 때마다 어댑터는 어댑터가 이전 단계에서 그리스에 삽입하는 새로운 출발점에 배치되었는지 확인하고있는 분배기를 추적. 그리스가 전체 구분선에 적용되면 N2 - 메틸 셀룰로오스는 중간 구획 이상하므로, 거꾸로 준비 P35 요리 중 하나를 설정하고 그것을 놓으십시오. 핀셋 한 쌍의와 접시의 바닥에 아래 버튼을 누르십시오. 네 모퉁이 ( "X"로 다이어그램에 표시된 왼쪽 상단, 오른쪽 아래, 오른쪽, 왼쪽 아래)에있는 구분선의 안쪽에 언론에 있는지 확인하십시오. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="그림 2" width="171" height="183"> 그림 2 : 구분선을 기름 치는 것 단계 참고 : 그것을 그리스의 음식과 완벽한 도장을 만드는 있도록 단단히 정도로 언론에 중요하지만, 너무 많은 압력이 추가 경우, axons는 측면 구획에 교차하지 않습니다. , hemostats를 들고 그것을 뒤집 및 구분선을 unclamp. 마지막으로, 단단히 중간 구역의 하단에 초점 현미경 첨부 분할기와 함께 요리를 놓으십시오. 그리스 로더로 세포가 중간 구획에 배치되면 그들이 누설 수 있도록 작은 장벽 (0.25 cm)를 확인하십시오. </li><li> 여러 문화, 측면 구획의 각 장소 DRG 미디어와 전지가 유지됩니다되는 배양기에서 위치를 설정하는 데 후. 문화가 몇 시간 동안 앉아 후 누출을 확인할 수 있습니다. 미디어가 중간 구획으로 유출있다면, 다음 문화 사용할 수 없습니다. 참고 : 여러가 새는되므로 먼저 기술을 배우고, 그것이, 실험에 필요한 이상의 문화를 설정하는 것이 중요합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="그림 3" width="254" height="191"> 그림 3 : "좋은 VS 새서 '문화 </li></ol> compartmented 문화의 유지 DRG 뉴런 <ol><li> 1 일 : 100ng/mL DRGN 미디어 + AraC과 측면 구획에서 미디어를 DRG 교체합니다. 절개를 수행하고 중심 구획 (100000 셀)에 세포를 추가합니다. </li><li> 일 2 : 미디어 센터 구획과 그리스의 장벽과 교류를 통해 흐르는 유체 때까지 테플론 분할기의 외부 10ng/mL 미디어 + AraC를 추가합니다. </li><li> 3 일 : 10ng/mL DRGN는 AraC를 생략로 AraC와 서라운드를 생략 100ng/mL DRGN하는 측면 구획에서 미디어를 교체하십시오. </li><li> 일 6 : 1ng/mL + AraC 및 DRG 미디어 + AraC으로 둘러싸고있는 측면 구획에서 미디어를 교체하십시오. </li><li> 일 9 : 실험에 사용. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="그림 4" width="267" height="148"> 그림 4 : 세포 기관과 말초 axons의 IHC 이미지 참고 : 미디어를 변경하면, 그것은 각각의 측면 구역의 상단에서 액체를 대기음하는 것이 중요합니다. 또한, 오직 서라운드에서 중간 구획 자체에서 미디어를 변경할 수없고, 그것이 중심에 그리스의 장벽을 통해 흘러가게 마십시오. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

이 비디오에서는, 우리는 culturing의 DRG의 뉴런에 사용하기 위해 compartmented 회의소를 준비하고 유지하는 방법을 증명하고있다. 제대로 완료,이 시스템은 neurotrophins 오래 axons에 걸쳐 신호를하는 메커니즘을 연구하기 위해 축삭에서 세포 기관의 분리 수 있습니다. 구획 사이에 유체 절연이 있기 때문에, 그것은 다른 구획에 영향을받지 않고 한 구역의 선택적 자극이나 치료 수 있습니다. Compartmented 챔버 문화는 우수 자궁 경부 신경, 망막 신경절의 뉴런과 뉴런에서 대뇌 피질의 교감 신경 등 다른 세포 유형을 지원할 수 있습니다. neurotrophin 신호 전달의 공간적 이해 neurodegenerative 장애의 치료에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 알츠하이머 병, 헌팅턴의 질환과 운동 신경 질환을 포함한 몇몇 neurodegenerative 장애는, axonal 교통의 결함과 관련 있습니다. 최근 연구 microfluidic 챔버 대신 이러한 compartmented 회의소를 사용했습니다. 4,5</s...

<table><tbody><tr><td>collagen</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>N2-methylcellulose 400CPS</td><td>시약</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon divider</td><td>기타</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>다른 다양한 종류의 디바이더를 사용할 수 있음</td></tr><tr><td>Pin rake</td><td>도구</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>Grease loader</td><td>도구</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>시약</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>시약</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>23 gauge luer stub adapter</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>90&amp;#x00B0; angle hemostats</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

뉴런은 멀리 대상 - 파생 성장 요소의 연결을 생존과 기능에 필요한 대상 조직을 신경을 분포시키다하는 세포 본체에서 제거됩니다 axonal 프로세스를 확장합니다. Neurotrophins은 특히 감각 뉴런을 innervating의 생존과 분화를 유지하기 위해 필요하지만, 이러한 목표 - 파생 neurotrophins은 innervating 뉴런의 세포 기관에 의사 소통 방법의 문제는 30 년 넘게 적극적인 연구 영역을했습니다. neurotrophin 신호가 세포 신체에 도달하는 방법 중 가장 일반적으로 인정 모델은 신호가 축삭을 따라 retrogradely이 신호를 운반 endosomes 것을 제안합니다. 역행 수송을 연구하기 위해, 문화 시스템은 원래 세포 시신은 axons으로부터 격리하는 로버트 Campenot에 의해 고안되었다. culturing 감각 뉴런의 recapitulates 대상 - 파생 neurotrophins의 생체내 다음 릴리스에서 발생하는 신경 세포 단말기의 선택적 자극에 대해 이러한 compartmented 회의소 준​​비의 기술. 장거리 미세 소관에 의존 역행 수송을 필요로 역행 신호 이벤트가 neurodegenerative 장애의 치료에 중요한 의미를했습니다.

여기서 우리는 지느러미 루트 신경의 culturing 감각 뉴런에 compartmented 회의소 준​​비 및 유지 관리의 기법을 설명합니다.

Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

뉴런은 세포체에서 멀리 떨어진 곳까지 축삭 돌기를 뻗어 표적 조직에 신경을 분포시키며, 이곳에서 표적 유래 성장 인자가 ...를 위해 필요합니다.

이 절차는 핀 레이크(pin rake)를 사용하여 콜라겐 코팅 플레이트 중앙에 스크래치를 만들고, 스크래치 중앙에 30 µL의 Methylcellulose를 피펫팅하는 것으로 시작합니다. 그리스 로더(grease loader)를 사용하여 각 디바이더에 그리스를 바른 후 콜라겐 코팅 플레이트에 부착합니다. E 15 쥐 배아 유래 세포 100,000개를 중앙 구획에 분주합니다.9일 후면 세포의 축삭이 측면 구획까지 뻗어 나가 실험 준비가 완료됩니다. 안녕하세요, 저는 Dana-Farber Cancer Institute 소아종양학과의 Rosalyn Siegel 박사 연구실 소속 Maria Murphy입니다. 오늘은 구획 배양 접시를 이용한 Dosa root ganglia 뉴런의 준비 및 유지 관리 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 뉴로트로핀(neurotrophin) 신호 전달을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 구획 챔버(compartmented chambers)를 설치하기 전, P 35 조직 배양 플레이트를 콜라겐으로 코팅해야 합니다.이를 위해 0.001 N HCl에 녹인 0.71 mg/mL 콜라겐 용액 1 mL를 플레이트에 추가하고 37 °C에서 2일 동안 배양합니다. 2일 후, 핀 레이크(pin rake)를 사용하여 콜라겐이 코팅된 플레이트 중앙에 긁힘(scratch)을 만듭니다. 이때 바깥쪽 방향으로 움직여 작업하십시오.그 다음, 스크래치의 중앙에 30 µL의 N two Methylcellulose를 도포합니다. 디쉬를 그대로 둡니다. 이어서, 23 gauge 루어 스텁 어댑터를 그리스 로더에 부착합니다.90도 각도 지혈 집게로 테플론 디바이더를 잡고, 현미경 아래에 디바이더가 위를 향하도록 평평하게 놓습니다. 현미경으로 관찰하면서 디바이더를 따라 그리스를 바릅니다. 어댑터를 새로운 시작점에 배치할 때마다 이전 단계에서 바른 그리스 부분에 삽입하여 그리스가 끊어지지 않고 연속적인 선으로 이어지도록 합니다.디바이더 전체에 그리스를 도포한 후, 준비된 P 35 디쉬 중 하나를 뒤집어 N two Methylcellulose가 중앙 구획 위에 오도록 배치합니다. 핀셋으로 디쉬 바닥을 누릅니다. 이때 디바이더 내부의 네 모서리를 확실하게 눌러주십시오.그리스가 디쉬와 완전히 밀착되어 밀봉될 수 있도록 충분히 세게 누르는 것이 중요합니다. 하지만 너무 과한 압력을 가하면 축삭이 측면 구획

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

이 비디오는 쥐 배아에서 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런을 분리하고 슈반 세포 전구체와 공동 배양하여 성숙한 슈반 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다. 분리된 DRG는 뉴런과 신경교세포를 분리하기 위해 처리됩니다. 분리된 세포를 배양하여 뉴런을 정제한 다음, 공동 배양 배지에서 슈반 세포 유사 세포(SCLC)와 공동 배양합니다. DRG 뉴런과의 상호 작용은 SCLC가 슈반 세포로 성숙하도록 유도합니다.

DRG 뉴런의 분리 및 Schwann 세포 전구체와의 공동 배양을 통해 Schwann 세포 생성

이 동영상은 콜라겐과 무반응성 그리스를 사용하여 3칸 세포 배양 시스템을 구축하는 방법을 보여줍니다. 이 시스템은 신경교종 세포와 축삭돌기 사이의 상호 작용을 실시간으로 관찰하는 데 사용됩니다.

신경 세포 배양을 위한 콜라겐 코팅 구획 배양 접시의 준비

이 비디오는 배측근신경절(DRG) 뉴런과 슈반 세포의 공동 배양을 보여줍니다. DRG 뉴런은 정렬된 축삭 성장을 위해 미리 늘어난 막에서 먼저 성장합니다. 그런 다음 슈반 세포(Schwann cell)를 도입하여 축삭돌기에 부착하여 축삭을 절연하고 신경 세포의 생존과 기능을 촉진합니다.

Pre-Stretched Membrane에서 Schwann 세포와 DRG 뉴런의 공동 배양

이 비디오는 배측근신경절(dorsal root ganglia, DRG)에서 뉴런을 채취하는 방법을 보여줍니다. 쥐의 척추에서 채취한 DRG를 분리하고 효소로 처리한 다음 기계적으로 해리하여 단세포 현탁액을 얻습니다. 뉴런은 밀도 구배 원심분리를 사용하여 신경교세포에서 분리되고 성장 배지에서 배양됩니다.

A Techniques for Haulsal Root Ganglia for Neuronal Cultures(신경 세포 배양을 위한 등뿌리 신경절의 수확 및 해리)

이 비디오는 등쪽 뿌리 신경절 이식과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 보여줍니다. 공동 배양 조건에서 아스코르브산은 슈반 세포가 수초화 형태로 분화되는 것을 촉진합니다. 슈반(Schwann) 세포는 축삭돌기를 여러 번 감싸 신경 기능에 필수적인 미엘린 수초(myelin sheath)를 만듭니다.

Neuron Myelination을 위한 Schwann Cells와 Dorsal Root Ganglion Explant의 공동 배양

이 비디오는 쥐의 척추에서 등뿌리신경절(DRG) 세포를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 척추에서 절제된 DRG는 효소로 처리되고 기계적으로 해리되어 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포는 각각 신경교세포 증식을 제한하고 신경 세포 성장을 촉진하는 억제제와 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양됩니다.

쥐의 척추 기둥에서 1차 등뿌리 신경절 세포 배양 확립

이 프로토콜은 랫트에서 분리된 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 분리와 축삭 정렬을 향상시키기 위한 정적 사전 스트레치 세포 배양 시스템에서 DRG 뉴런의 배양을 설명하며, 이후 슈반 세포(SC)의 공동 배양은 수초화를 촉진합니다.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

지 루트 중추 (DRG) 주 문화 자주 생리 기능 또는 감각 신경에서 병리학 관련 이벤트를 공부 하는 데 사용 됩니다. 여기, 허리 DRG 문화 neuropeptide FF 수용 체 선택적 길 항 제와 함께 2 자극 입력 신경 전달 물질의 릴리스를 감지를 사용 하 여를 설명 합니다.

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

이 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐에서 이식된 배근 신경절(DRG)을 수확하고 배양하는 기술을 제공합니다.

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

배우세요 척추신경절 감각신경원의 격리 배양 기술로 신경돌기 성장과 신경영양인자 신호전달을 연구하세요. 이 방법은 신경과학 실험에 필수적인 도구를 제공합니다.

Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

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