칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

이 비디오는 HRP 접합 2차 항체를 사용하여 병아리 배아에서 전체 마운트 면역조직화학의 여러 단계를 보여줍니다. 첫째, 배아는 파라 포름알데히드에 고정됩니다. 그런 다음 내인성 과산화효소 활성이 소멸됩니다.

그런 다음 배아는 1차 항체에서 배양됩니다. 여러 번의 세척 후, 배아를 2차 항체에서 배양하고 HRP에 접합된 색 반응이 DAB 기질을 사용하여 드러나고 항체 염색이 주황색으로 나타납니다. 형광 항체를 사용하는 것에 비해 이 방법의 장점은 왁스 절편을 위해 배아를 처리할 수 있으므로 단면의 항원 부위를 연구할 수 있다는 것입니다.

안녕하세요, 저는 휴스턴에 있는 텍사스 A와 M에 있는 환경 및 게놈 의학 센터의 FIN 실험실에서 근무하는 Delphine입니다. 오늘 우리는 호르몬 마운트 항체를 수행하는 절차를 보여 드리고, HRP 접합 항체를 사용하여 뺨 배아를 염색하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 항간질제로 치료한 후 배아의 형태를 연구합니다.

이제 병아리 배아에 대해 전체 마운트 면역조직화학을 수행하기 시작하겠습니다. 먼저 집게로 껍질을 두드려 껍질 조각을 제거하여 계란을 엽니다. 집게로 두꺼운 알부민을 제거하고 배아가 위를 향하도록 거친 집게로 노른자 자루를 기울입니다.

그런 다음 가는 가위를 융합하여 배아 주위를 사각형의 난황자 자루로 자릅니다. 숟가락으로 노른자에서 배아를 제거하고 해부 현미경으로 PBS가 담긴 접시에 담습니다. 노른자의 막을 조심스럽게 제거하고 배아를 PBS가 들어있는 신선한 접시에 옮깁니다.

배아를 이식한 후 집게와 곤충 핀으로 배아를 고정하고 PBS를 흡인합니다. 이를 PBS에서 4%PFA로 대체하고 배아가 실온에서 1시간 고정되도록 하여 잠재적인 미생물 오염을 최소화합니다. 배아가 고정된 후 다음 단계가 모두 수행될 때 D 탈이온화된 H2O를 사용하여 정착액을 흡인하고 화학 폐기물로 적절하게 처리합니다.

접시에 BS를 채웁니다. 다음으로, 현미해부 칼을 사용하여 배아 주위를 사각형으로 잘라 여분의 배아 막을 제거합니다. 핀을 제거한 후 집게로 곤충 핀을 제거합니다. 끝이 뭉툭한 목초지 피펫을 사용하여 배아를 PBT가 들어 있는 섬광 바이알로 옮깁니다.

PBT로 배아를 각각 10분씩 3회 세척합니다. 섬광 바이알에서 PBT를 제거하고 잠재적인 내인성 과산화효소를 비활성화하기 위해 0.3%H 2 0 2를 함유한 PBTX로 교체합니다. 돌연변이원에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

PBT로 배아를 먼저 10분씩 3회, 30분씩 3회 세척합니다. 배아를 항체로 염색합니다. 먼저 배아를 차단 완충액 또는 1%BSA 1%NGS에서 1시간 동안 세척합니다.

NGS를 사용하는 이유는 2차 항체가 염소에서 자라기 때문입니다. 배양 후 실온에서 1시간 동안 돌연변이체에서 배양하고, 차단 완충액에서 1:1로 1차 항체를 희석하고, 이 용액에서 배아를 섭씨 4도에서 2일 동안 배양합니다. 뮤테이터에서.

1차 항체 희석 인자는 1차 항체의 선택에 따라 달라집니다. 여기서 우리는 슈퍼 나틴으로 제공되는 발달 연구 하이브리드 DOMA 은행의 항체를 사용합니다. 우리는 그것을 블로킹 버퍼에서 일대일로 희석합니다.

다음으로, PBT로 10분 세척을 3회 수행한 다음 PBT로 1시간 세척을 3회 수행합니다. 세척 후 2차 항체를 차단 완충액에 1-2, 500으로 희석합니다. 이 경우, 과산화효소는 염소 anti-US IgG를 접합하고 이 용액에서 배아를 하룻밤 동안 돌연변이물질에서 섭씨 4도에서 배양했습니다.

PBT로 10분 세척 3회 후 PBT로 1시간 세척 3회 수행하여 염색된 배아의 색상 반응을 현상합니다. 처음 두 번의 20분 세척은 트리스 버퍼 100 밀리몰 트리스, HCL pH 7.4입니다. 다음으로, 배아가 들어 있는 바이알에서 마지막 TS 완충액 세척을 제거하고 5ml DAB 용액으로 교체합니다.

돌연변이원의 어둠 속에 20분 동안 보관합니다. 10% 표백제 용액이 들어 있는 양동이에 einor 팁을 폐기하십시오. DAB의 오염을 제거하려면 16마이크로리터를 추가하십시오.

재고 H 2 0 2를 DAB에 배아를 포함하는 바이알에 넣습니다. 어두운 곳에 보관하십시오 10분 후 색상 반응이 완료되면 현미경으로 반응을 모니터링합니다. DAB는 표백제 통에 버리고 5밀리리터로 교체하십시오.

수돗물. 다음으로, PBS에서 10분 동안 두 번 세척하여 사진 및 왁스 절편을 처리합니다. 염색된 배아를 에탄올 시리즈, 25%50%75% 및 100%로 각각 10분 동안 탈수합니다.

탈수 후 에탄올을 0.5-1 밀리리터 시더우드 오일로 교체하십시오. 이것은 시더우드 오일에서 사진을 찍기 위한 배아를 반투명하게 만들 것입니다. 사진 촬영 후 배아를 바이알에 다시 넣고 시더우드 오일을 100% 에탄올로 교체합니다.

마지막으로 100% 에탄올에서 에탄올을 5% 빠른 녹색 FCF로 대체하고 3분 동안 배양합니다. 이 단계는 조직학을 위해 배아를 가시화합니다. 빠른 녹색 FCF 용액을 100% 에탄올로 교체하고 조직학을 위한 프로세스를 수행합니다.

다음은 염색된 배아의 세 가지 예입니다. 이 11기 배아는 15.3 B 9로 표시되어 있습니다. 하나는 Jane dod와 Tom Gessel의 실험실에서 개발된 결절 특이적 항체입니다.

DAB에서 2분 후, 배아는 여전히 투명합니다. DAB에서 20분 후 마디 코드에 약간의 레이블이 나타납니다. 마지막으로 40분이 지나면 결절 코드의 라벨링이 완료됩니다.

이 예에서는 Tom Jessel의 실험실에서 개발된 항체인 PAC seven이 어떻게 신경관 폐쇄의 초기 단계와 중뇌에서 나오는 두개골 신경능선 세포를 인식하는지 보여줍니다. 여기서 배아는 데이비드 윌킨슨(David Wilkinson)의 실험실에서 채취한 Croc 20 프로브로 표지되어 있으며, 그 다음에는 하나의 항체가 없습니다. 방금 전체 마운트 면역조직화학을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차는 이전에 전체 마운트 현장 교잡을 위해 처리된 배아에도 사용할 수 있습니다. 이 경우, in-situ hybridization 후 1시간 동안 배아를 잠시 고정한 후 항체 염색을 진행합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.