Name: 칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 병아리 배아에서 전체 마운트 면역조직화학 기법을 사용하여 항원 발현 패턴을 시각화하는 방법을. HRP 결합 항체와 DAB 기질을 활용하여 발달 생물학 연구에 필수적인 이 기술을 익히세요.

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(J. 다드, TM Jessell 및 A. 가와 카미)에 의해 개발된 단클론 항체는 (15.3B9, PAX7) 생물 과학학과, 아이오와 대학에서 NICHD 유지의 후원하에 개발된 발달 연구 브리 도마 은행에서 얻은되었습니다 아이오와. DP는 약물 남용에있는 국립 연구소에서 루스 Kirschstein 수상 1F32 - 01A1 DA021977의받는 사람입니다. 이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.

I. 도식 개요 : 이 비디오는 여자의 배아에서 전체 마운트 immunohistochemistry의 여러 단계를 보여줍니다. 첫째, 배아는 PFA에서 수정된 [IHC1]. 그런 다음, 내생 퍼옥시데이즈 활동은 침묵이다 [IHC2]. 배아는 다음 주 항체 [IHC3]에서 incubated입니다. 여러 세척 후 배아가 이차 항체에 incubated입니다 [IHC4]; 컬러 반응이 DAB [IHC5]를 사용하고 계시이며 항체 얼룩이 나타납니다 오렌지 [IHC6]. <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure 1.png" alt="그림 1" width="600" height="573" /> 1 부 : 배아를 고정 <ol><li> 여자의 배아에 대한 전체 마운트 immunohistochemistry를 수행하려면 먼저 집게로 껍질을 감청하고 껍질 조각을 제거하여 계란을 엽니다. </li><li> 포셉와 두꺼운 알부민을 제거하고, 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉로 난황을 기울. </li><li> 좋은 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. 숟가락으로 노른자에서 배아를 제거하고, PBS를 포함하는 접시에 장소. </li><li> 해부 현미경에서 신중하게 안정과 노른자와 PBS를 포함하는 신선한 요리로 배아 전송을 제거합니다. </li><li> 포셉 및 곤충 핀으로 배아를 핀, 그리고 PBS를 대기음. PBS에서 4퍼센트 PFA이로 교체하고, 배아는 RT에 1H를 해결하실 수 있습니다. </li></ol> 2 부 : 항체 단계에 대비하여 배아 <ol><li> 잠재적인 미생물 오염을 최소화하려면, 다음 단계에서 모든 ddH 2 O를 사용합니다. </li><li> 배아가 수정되면 고정력있는 솔루션을 대기음 화학 폐기물을 적절히 처리. PBS로 요리를 입력합니다. </li><li> 다음, microdissection 나이프를 사용하여 extraembryonic 세포막을 제거하는 배아 주위에 사각형을 했네요. 포셉과 곤충 핀을 제거합니다. </li><li> 핀이 제거된 후, PBT (PBS 산도 7.4, 0.5 % 트리톤 X)를 포함하는 섬광의 약병에 배아를 전송하기 위해 뭉툭한 끝 파스퇴르 피펫을 사용합니다. </li><li> 십분 각, PBT 3 번 배아를 씻으십시오. </li><li> 섬광의 병을에서 PBT를 제거하고, PBTx 잠재 내생 퍼옥시데이즈를 inactivate하기 위해 0.3 % H 2 O 2를 포함하는로 바꿉니다. </li><li> nutator에 RT에서 2 시간을위한 부화. </li><li> 다음 PBT 10 분 각 3 회 30 분 각 3 회와 배아를 씻으십시오. </li></ol> 파트 3 : 항체 인큐베이션 <ol><li> 항체와 배아를 얼룩이, 차단 버퍼 또는 1% BSA / 1 % NGS / PBT (보조 항체가 염소에서 제기되기 때문에 우리가 NGS 사용) 한 시간 동안 배아를 세척하여 시작합니다. RT 한 시간 동안 nutator에 품어. </li><li> 4 이일 ° C nutator에이 솔루션에서 차단 버퍼 및 부화 배 (胚)의 기본 항체 1시 1분을 희석. 차 항체 희석 요소는 기본 항체의 선택에 따라 달라집니다. 여기서 우리는 supernatent대로 제시됩니다 발달 연구 브리 도마 은행에서 항체를 사용합니다. 우리는 버퍼를 차단에서 1시 1분을 희석. </li><li> 다음, PBT 3 1 시간 세척 다음 PBT 3 10 분 세척을 수행합니다. </li><li> 세척 후, 차단 버퍼에 보조 항체를 1:2500 희석 (이 경우 퍼옥시데이즈 복합 - 염소 항 마우스 IgG (H + L),이 솔루션에 품어 배아에서 4 O / N ° nutator에 C. </li><li> PBT 3 1 시간 세척 다음 PBT 3 10 분 세척을 수행합니다. </li></ol> 제 3 부 : 색상 반응 <ol><li> 스테인드 배아의 색상 반응을 개발하려면 먼저 트리스 버퍼 (100mM 트리스 HCL, 산도 7.4) 2 20 분 세척을 수행합니다. </li><li> 한편 펌 후드 아래에 500μg/ml의 트리스 버퍼에 DAB의 기판 (3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride) 디졸브, 어둠 속에서 솔루션을 유지, 얼음. </li><li> 병을 포함 배아에서 마지막 트리스 버퍼를 제거하고 세척 단계를 3.2에서 5ml DAB 솔루션으로 대체합니다. 20 MN에 대한 nutator에 어둠 속에 보관. DAB를 오염을 제거하다하기 위해 10 % 표백 용액이 들어있는 양동이에 Eppendorf 끝 처리. </li><li> 한편 0.3 %의 주식 얼음 DH 2 O에서 H 2 O 2를 준비합니다. </li><li> DAB의 배아를 포함 유리병에 50μl 재고 H 2 O 2를 추가합니다. 어둠 속에 보관. 1~2분 후, 현미경으로 반응을 모니터링합니다. </li></ol> 4 부 : 사진 및 조직학에 대한 엠브료 처리 <ol><li> 색상 반응이 완료되면, 표백 양동이에 DAB 처분. 5 ML의 수돗물로 대체합니다. </li><li> PBS 2 10 분 세척을 수행합니다. </li><li> 사진 및 왁스 sectioning에 대한 처리하기 위해 10 분 각각에 대해 (25 %, 50 %, 75 % 및 100 %) 에탄올 시리즈 탈수. </li><li> 1 ML 시더 우드 오일 (이것은 배아 반투명하겠습니다) - 0.5와 에탄올을 대체합니다. 삼목 나무 기름의 사진을위한 과정입니다. </li><li> 사진 다음, 유리병에 배아를 반환하고 100 % 에탄올로 삼목 나무 오일을 교체하십시오. 에탄올 단계를 반복합니다. </li><li> E를 교체100 % 에탄올에 5% 빠른 그린 FCF와 thanol, 3 분 (이 단계는 조직학에 대한 배아 볼 것입니다)에 품어. 조직학에 대한 100 %의 에탄올과 프로세스 빠른 그린 FCF 솔루션을 교체합니다. </li></ol> 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="그림 2" width="600" height="498" /> 아래의 예제에서, 배아는 단계 HH 10 (A), 12 (B), 11 (C)에서 해부되며 태아는 몸의 신경 crestas에 PAX 7 표현을 보여주뿐만 아니라 somites과 신경 튜브 (A, B)에; 년 (C), notochord가 15.3B9합니다 (- 1) (발달 연구 브리 도마 은행에서 제공하는 항체)에 표시됩니다.

<ol><li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system%3A+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li>
<li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+HGF%2FSF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen%27s+node+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li>
<li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
</ol>

이 동영상은 젊은 여자는 배아의 전체 마운트 항체 얼룩을 수행하는 다른 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 기본적으로 여자가 2,3의 소설 항체의 공간 및 시간적 특성을 위해 사용뿐만 아니라 모욕 4 다음 배아 기형을 결정하는 것으로 알려진 antigenic 마커의 사용입니다.

<table><tbody><tr><td>알</td><td></td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fertile</td><td>수정란, HH4 (16 hr)</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 또는 유사 모델</td><td></td></tr><tr><td>Marsh 자동 배양기</td><td>기타</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>곡선 핀셋 (1)</td><td>도구</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 (2)</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td></td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 접시</td><td>도구</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>고무 벌브</td><td>도구</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 모세관 피펫</td><td>도구</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td>화염 위에서 끝을 둥글게 처리함</td></tr><tr><td>미세 해부용 칼</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>고정 후 주변 막으로부터 배아를 절단하는 데 사용</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 경화제 및 베이스</td><td>시약</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>경화제 1부분과 베이스 9부분을 혼합; 37C에서 밤새(O/N) 굳힘</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>시약</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>시약</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>1차 항체</td><td>시약</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4G11, 15.3B9, PAX7</td><td>이 항체들의 경우, 연구자들이 마우스 공여자를 사용함</td></tr><tr><td>Peroxidase 접합 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>시약</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine tetrahydrochloride</td><td>시약</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34001</td><td>-20에서 보관; 사용 전 병을 상온(RT)으로 데울 것</td></tr><tr><td>삼나무유</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W522503</td><td></td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>미뉴텐 핀 (지름 0.2mm)</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr></tbody></table>

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브 및 체절 개발에 항체 표현을 공부를위한 이상적인 도구가합니다. 이 동영상은 HRP 복합 이차 항체를 사용하여 전체 마운트 항체 얼룩의 여러 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 내생 퍼옥시데이즈은 inactivated이며 배 (胚)는 다음 주 항체에 노출됩니다. 여러 세척 후, 배아는 HRP에 복합 보조 항체와 incubated입니다. 퍼옥시데이즈 활동 diaminobenzidine 기판과 반응을 사용하여 드러났습니다. 마지막으로, 배 (胚)는 고정하고 사진과 sectioning에 대한 처리됩니다. 형광 항체의 사용을 통해이 방법의 장점은 그 배아가 있으므로 단면의 항원 사이트의 연구를 지원, 왁스 sectioning에 대해 처리할 수 있습니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다<sup&gt; 1</sup&gt;.

이 동영상은 모든 마운트 immunohistochemistry, 항원의 공간 및 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 태아의 시각 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다.

닭 배아는 초기 배아 발달 연구에 있어 매우 가치 있는 도구입니다. 투명성과 접근성, 그리고 조작의 용이성 덕분에 이는 ...

이 영상에서는 HRP 접합 2차 항체를 이용한 병아리 배아의 전체 마운트 면역조직화학 염색의 다양한 단계들을 보여줍니다. 먼저, 배아를 파라포름알데히드로 고정합니다. 그 후 내인성 퍼옥시다제 활성을 억제합니다.그 후 배아를 1차 항체에서 배양합니다. 여러 번 세척한 뒤, 배아를 HRP가 결합된 2차 항체에서 배양합니다. DAB 기질을 사용하여 발색 반응을 나타내면 항체 염색 부위가 주황색으로 나타납니다. 형광 항체를 사용하는 것보다 이 방법이 가진 장점은 배아를 파라핀 섹셔닝 공정으로 처리할 수 있어, 항원 부위를 횡단면으로 연구할 수 있다는 점입니다.안녕하세요, 저는 텍사스 A&M 대학교 휴스턴 캠퍼스 환경 및 게놈 의학 센터 FIN 연구실의 Delphine입니다. 오늘은 HRP 접합 항체를 사용하여 닭 배아에서 호르몬 마운트 항체 염색을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 항경련제 처리 후 배아의 형태학적 변화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 병아리 배아의 전장 면역조직화학염색(whole mount immunohistochemistry)을 수행해 보겠습니다. 먼저 핀셋으로 껍질을 톡톡 두드려 깨뜨린 후 껍질 조각들을 제거하여 알을 엽니다. 핀셋으로 두꺼운 알부민을 제거하고, 거친 핀셋으로 난황낭을 기울여 배아가 위를 향하게 합니다.다음으로 미세 가위를 사용하여 배아 주변의 난황낭을 정사각형 모양으로 절단합니다. 숟가락을 이용해 난황에서 배아를 분리한 후, 해부 현미경 하에서 PBS가 담긴 접시에 놓습니다. 난황에 붙은 막을 조심스럽게 제거하고 배아를 PBS가 담긴 새 접시로 옮깁니다.배아를 옮긴 후, 포셉과 곤충 핀으로 배아를 고정하고 PBS를 흡입하여 제거합니다. 이를 4% PFA in PBS로 교체하고, 잠재적인 미생물 오염을 최소화하기 위해 실온에서 1시간 동안 배아를 고정합니다. 배아가 고정된 이후의 모든 단계에서는 탈이온수(deionized H2O)를 사용하며, 고정액은 흡입하여 화학 폐기물로 적절히 처리합니다.접시에 BS를 채웁니다. 다음으로, 미세해부도를 사용하여 배아 주변을 사각형으로 절개하여 여분의 배아막을 제거합니다. 핀을 제거한 후 핀셋으로 곤충 핀을 제거합니다. 끝이 뭉툭한 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 PBT가 들어 있는 신틸레이션 바이알로 옮깁니다.배아를 PBT로 10분씩 3회 세척합니다. 신틸레이션 바이알에서 PBT를 제거하고, 잠재적인 내인성 peroxidase를 비활성화하기 위해 0.3%H 2 0 2가 포함된 PBTX로 교체합니다. 흔들개(mutator)를 사용하여 상온에서 2시간 동안 배양합니다.먼저 배아를 PBT로 10분씩 3회 세척한 다음, 30분씩 3회 세척합니다. 항체로 배아를 염색하기 위해, 블로킹 버퍼 또는 1%BSA 1%NGS에서 1시간 동안 배아를 세척하며 시작합니다.2차 항체가 염소에서 생성되었으므로 NGS를 사용합니다. 배양 후 셰이커(mutator)에서 실온으로 1시간 동안 반응시킵니다. 1차 항체를 블로킹 버퍼와 1:1 비율로 희석한 후, 배아를 이 용액에 넣어 4°C에서 2일 동안 배양합니다. 셰이커(mutator)를 사용하십시오.1차 항체 희석 배수는 선택한 1차 항체에 따라 달라집니다. 여기서는 상층액 형태로 제공되는 developmental studies hybrid DOMA 뱅크의 항체를 사용합니다. 이를 블로킹 완충액으로 1:1 비율로 희석합니다.다음으로, PBT에서 10분씩 3회 세척한 후, 다시 PBT에서 1시간씩 3회 세척합니다. 세척 후, 2차 항체를 블로킹 버퍼에 1:2,500 비율로 희석합니다. 본 실험에서는 peroxidase가 접합된 goat anti-US IgG를 사용하며, 배아를 이 용액에 넣어 4°C에서 하룻밤 동안 진탕기(mutator)로 인큐베이션합니다.염색된 배아의 발색 반응을 유도하기 위해 PBT로 10분씩 3회 세척한 후, 이어서 PBT로 1시간씩 3회 세척합니다. 처음에는 100 millimolar tris, HCL pH 7.4 tris 버퍼로 20분씩 2회 세척합니다. 다음으로, 배아가 들어 있는 바이알에서 마지막 TS 버퍼 세척액을 제거하고 5 mL의 DAB 용액으로 교체합니다.뮤테이터(mutator)에서 20분 동안 암소 보관하십시오. 사용한 팁은 10% 표백액이 담긴 버킷에 폐기하십시오. DAB를 오염 제거하기 위해 16 µL를 추가하십시오.배아들이 들어 있는 DAB 바이알에 H₂O₂ 스톡 용액을 첨가합니다. 암실 상태로 유지하십시오. 10분 후, 현미경으로 반응을 관찰하여 발색 반응이 완료되었는지 확인합니다. 사용한 DAB는 표백제 버킷에 폐기하고, 5 mL로 교체하십시오.수돗물로 헹굽니다. 다음으로, 사진 촬영 및 파라핀 섹션을 위해 PBS로 10분씩 두 번 세척합니다. 염색된 배아를 25%, 50%, 75%, 100% 에탄올 시리즈로 각각 10분 동안 탈수합니다.탈수 후, 에탄올을 0.5에서 1 mL의 시더우드 오일(cedarwood oil)로 교체합니다. 이렇게 하면 배아가 투명해져 시더우드 오일 내에서 촬영이 가능해집니다. 촬영 후에는 배아를 다시 바이알에 넣고 시더우드 오일을 100% 에탄올로 교체합니다.마지막으로, 에탄올을 100% ethanol에 희석한 5% fast green FCF로 교체하고 3분 동안 배양합니다. 이 단계는 조직학적 분석을 위해 배아를 시각화하는 과정입니다. fast green FCF 용액을 100% ethanol로 교체하고 조직학적 처리를 진행합니다.염색된 배아의 세 가지 예시입니다. 이 11단계 배아들은 15.3 B nine 또는 nodal cord 특이적 항체로 표지되었습니다. 이 항체는 Jane dod와 Tom Gessel의 실험실에서 개발되었습니다.DAB 처리 2분 후에도 배아는 여전히 투명한 상태입니다. 20분 후에는 결절삭(nodal cord)에서 약한 표지가 나타납니다. 최종적으로 40분 후가 되면 결절삭의 표지가 완료됩니다.본 예제에서는 Tom Jessel 연구실에서 개발한 항체인 PAC seven이 신경관 폐쇄의 초기 단계와 중뇌에서 유래하는 두개 신경능 세포를 어떻게 인식하는지 보여줍니다. 여기에서 배아는 David Wilkinson 연구실의 Croc 20 프로브로 표지한 후, 하나의 항체를 사용하여 염색하였습니다. 지금까지 닭 배아를 이용한 전장 면역조직화학 염색법을 수행하는 방법을 설명해 드렸습니다.이 절차는 이전에 전신 내 현장 하이브리드화(whole mount in situ hybridization) 처리를 거친 배아에도 적용할 수 있습니다. 이 경우, 내 현장 하이브리드화 후 배아를 1시간 동안 짧게 고정시킨 다음 항체 염색을 진행하십시오. 이것으로 모두 끝났습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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