Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

절차는 마우스 마취와 수술 부위 준비로 시작합니다. 그 다음 마우스를 정위 고정 기기에 엎드린 자세로 배치합니다. 후두골 하단에 피부 시상 절개를 가하고, 정중선을 따라 피하 조직과 목 근육을 둔성 박리합니다.

그 다음, 고정된 머리와 몸체가 135도 각도를 이루도록 몸의 뒷부분을 눕힌 뒤, 유리 모세관으로 대후두공(cisterna magna)의 경막을 관통하여 뇌척수액(CSF)을 수집합니다. 뇌척수액 샘플링 후에는 근육을 다시 정렬하고 피부를 봉합하며, 탈수를 방지하기 위해 0.9% NaCl 식염수 약 1mL를 피하 주사하고 마우스가 회복될 때까지 따뜻하게 유지합니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 Top Institute의 Dr. Karen Duff 연구실의 Liu입니다.

오늘은 마우스의 시스terna magna(대조)에서 뇌척수액을 수집하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 기술을 이용하면 2~3개월 간격으로 동일한 마우스에서 최대 3회까지 연속적인 CSF 샘플을 수집할 수 있습니다. 저희 실험실에서는 이 기술을 사용하여 알츠하이머병 형질전환 마우스 모델의 연령별 CSF Aβ 또는 tau 수치를 결정하고, 이 값들을 뇌의 수치와 상관 분석합니다.

마지막으로, 우리는 질병의 진행과 마우스 대상 치료 시험을 위한 잠재적 생물학적 마커로서 CSFA beta 또는 tau 수치의 가능성에 주목하고자 합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 위해서는 마이크로 파이펫 풀러(micro pipette puller)를 사용하여 모세관을 제작해야 합니다.

여기에 사용된 모세관은 Sutter Instruments 사의 BOA silicate glass B 175 10이며, 열 지수(heat index)를 300으로, 압력 지수(pressure index)를 330으로 설정한 Sutter P 87 flaming micro pipette puller를 사용하여 제작합니다. 유리 모세관의 길이는 5cm이며 끝부분이 가늘게 테이퍼진 형태입니다. 모세관의 끝부분은 가위로 다듬어 내경이 약 0.5mm가 되도록 합니다.

수술 절차는 케타민 100 mg/kg과 자일라진 10 mg/kg을 복강 내로 투여하여 마우스를 마취시키는 것으로 시작하며, 마취 동안 마우스를 37 °C 인큐베이터에서 따뜻하게 유지합니다. 발가락 꼬집기 반응(toe pinch withdrawal reflex)을 통해 동물이 완전히 마취되었음을 확인한 후 목 부위를 제모하고, David Kink 사의 것과 같은 정위 고정 장치(stereotaxic instrument)에 마우스를 배치합니다. 가열 패드와 직접 접촉하도록 직장 온도 프로브를 삽입하여 마우스의 체온에 따라 패드의 열을 조절할 수 있도록 합니다.

헤드 어댑터로 머리를 고정하고, 목 피부를 10% povidone iodine과 70% ethanol로 3회 닦아낸 후 머리의 후측 부분 또는 후두부 아래쪽에 시상 절개를 가합니다. 다음 단계들은 해부 현미경 하에서 둔두용 핀셋을 사용하여 수행해야 합니다. subcutaneous tissue와 muscles M by ventor services 및 M rectus capita dorsalis major를 분리하여 sternum magna의 경막이 노출되도록 합니다. 마이크로 리트랙터를 적절히 사용하여 근육을 벌린 상태로 유지하십시오.

마지막으로, 머리가 몸과 135도 각도가 되도록 마우스를 눕힙니다. 이제 CSF 수집을 위한 준비가 완료되었습니다. 대조(cisterna magna)에서 CSF를 수집하는 이 기술은 이전에 발표된 바 있습니다.

해부 현미경 하의 그림 1A. 경막은 반짝이고 투명한 역삼각형 모양으로 나타나며, 이를 통해 연수와 주요 혈관이 보입니다. 척수경막동맥(Arteria dural spinella), 그림 1B. 연수 및 인접한 뇌척수액(CSF) 공간의 혈액 순환 맥동을 확인할 수 있습니다.

멸균 면봉으로 경막을 닦아 건조시킨 후, 척수 배측 동맥의 외측 경막을 통해 cisterna magna로 모세관을 삽입합니다. 모세관이 정확하게 삽입되면 저항감의 뚜렷한 변화가 느껴지며, 이때 뇌척수액(CSF)이 모세관 내부로 흐르게 됩니다. 뇌척수액 수집이 완료되면 모세관을 조심스럽게 제거하고, 내경 1 mm의 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 3 mL 주사기에 연결합니다.

CSF를 0.5 milliliter 튜브에 주입합니다. 튜브에 라벨을 부착하고 즉시 드라이아이스에서 동결시킵니다. 동결 후, CSF를 -80 °C 냉동고로 옮깁니다.

방금 시연한 샘플링 기술은 매우 부드러워, 2~3개월의 간격을 두고 동일한 마우스에서 후속 CSF 샘플을 채취할 수 있게 해줍니다. 따라서 목 부위의 샘플링 후에는 근육과 피부를 다시 정렬하고 봉합사로 폐쇄해야 합니다. 절개 부위를 봉합한 후, 마우스의 수분을 보충하기 위해 약 1mL의 0.9% NACL 식염수를 피하 주사하십시오.

마우스가 회복될 때까지 약 37 °C로 따뜻하게 유지하십시오. 수술 후 1일째와 7일째에 체중을 측정하십시오. 지금까지 마우스의 시스템 맥(system mag)에서 뇌척수액을 수집하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 기억해야 할 세 가지 중요한 사항이 있습니다. 첫째, Cy Magna의 rotor가 최대한 노출될 수 있도록 정위 고정 틀(stereotactic frame) 위에 마우스의 머리와 몸체를 적절하게 배치하십시오. 둘째, 모세관으로 durometer를 관통할 때 혈관을 세심하게 피하십시오.

그렇지 않으면 샘플이 혈액에 의해 오염될 것입니다. 마지막으로, 저체온증을 방지하기 위해 전체 과정 동안 마우스의 체온을 따뜻하게 유지해야 함을 기억하십시오. 저체온증은 마우스에게 해로울 뿐만 아니라, beta 생산을 유도하거나 tall hypo phosphorylation 관계를 유발하여 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

이상입니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.