Name: Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 학습하세요 마우스 뇌척수액 직렬 채취 기법을 통해 알츠하이머병 바이오마커 Aβ와 tau 수치를 정밀 측정하는 방법을. 이 기술은 동일 마우스에서 반복 샘플링이 가능하여 질병 진행을 장기적으로 추적할 수 있습니다.

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우리 작품은 NIH 보조금 NS048447 및 AG017216to KD에 의해 지원됩니다. 리 리우는 원래 프로토콜의 개발 기간 동안 자신의 감독 및 지원에 대한 박사 Heikki Tanila을 (쿠오 피오 대학, 쿠오 피오, 핀란드) 감사드립니다.

유리 모세관 튜브를 풀링 <ol><li> 유리 모세관은 셔터 악기 부동산 (Borosilicate 유리, B100 - 75 - 10)에서 구입할 수 있습니다. </li><li> 서터에서 P - 87 300 세트 열을 색인과 330에 설정된 압력 지수와 micropipette 풀러 플라밍. 모세관 튜브를 당겨 </li><li> 테이퍼 팁에 대해 0.5 mm의 내경을 가지고 있도록, 가위로 유리 모세관 튜브의 끝부분을 낸다. </li></ol> CSF에 대한 Cisterna 마그나 찔린 기술 CSF 샘플은 cisterna 마그나 (그림 1) 이전에 한 출판 되었음 방법을 사용에서 가져옵니다. <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_2/960_Figure-01.png" alt="뇌 해부학 다이어그램: 소뇌, 수조, 피질, 뇌간 라벨." width="432" height="184" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 1"> 그림 1 1. 생쥐에 마취제 (100mg/kg)과 xylazine (10mg/kg), 관리 intraperitoneally에 의해 anesthesized 있습니다. 마취 유도의 기간 동안, 생쥐는 37 O C 인큐베이터에 보관됩니다. 2. 목 피부는 면도 있으며, 마우스는 다음 손난로의 직접적인 접촉과 stereotaxic 악기에 경향이 배치됩니다. 가열 패드에 의해 생산되는 열을 체온의 변화에​​ 대응 조정되도록 직장 온도 프로브는 항문에 삽입됩니다. 머리는 머리 어댑터 보안입니다. 외과 사이트는 70 %의 에탄올 (3 번 반복) 다음, 10 % povidone의 요오드로 채취하고, 피부의 화살 절개는 후두에 열등 이루어집니다. 3. 해부 현미경 아래 피하 조직과 근육이 (M. biventer cervicis 및 M. rectus capitis 발등 전공) 포셉과 무딘 절개로 구분됩니다. microretractors의 두 사람이 떨어져 근육을 보유하는 데 사용됩니다. 4. 마우스는 머리가 시체와 함께 거의 135 O 각도를 형성 있도록 누웠지입니다. 5. 해부 현미경 아래에서 cisterna 마그나의 두라 메이터은 모수의 oblongata 및 주요 혈관 (arteria 발등 spinalis) 및 CSF의 공간 (그림 2) 표시되는를 통해 반짝 이는 맑은 역방향 삼각형으로 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_3/960_Figure-02.png" alt="외과적 해부학 시연; 해부 절차; 조직 노출; 교육 목적." width="304" height="307" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 2"> 그림 2 6. 두라 메이터는 멸균 면봉과 건조 blotted 있습니다. arteria 발등 spinalis (그림 2) 측면 두라 메이터를 통해 citerna 마그나에 모세관에 침투. 모세관 튜브 삽입에 저항에 눈에 띄게 변화에 따라, CSF는 모세관으로 흐르고 있습니다. 7. 조심스럽게 모세관 튜브를 제거하고 1mm 내경을 가진 폴리에틸렌 튜브를 통해 3 ML의 주사기에 연결합니다. 미리 표시 0.5 ML eppendorf 튜브에 CSF를 주사하고, 드라이 아이스에 즉시 튜브를 동결하고 -80 ° C 냉동고에 그것을 전송합니다. 8. CSF 샘플링 후, 근육이 다시 정렬하며, 피부가 (4-0, Ethicon, 존슨 앤 존슨) 봉합합니다. 0.9 % NaCl의 약 1 ML은 드 수화를 방지하기 위해 subcutaneously 주입니다. 마우스가 복구까지 체온을 유지하기 위해 인큐베이터에 보관되며 마우스의 무게는 1 일, 그리고 수술 후 일주를 감시하고 있습니다. 결과 및 토론 우리는 감지 플라즈마 오염없이 마우스에서 CSF의 시리얼 샘플링에 대한 신뢰성이 높은 프로토콜을 설명했다. 1. 전체 절차는 일반적으로 마우스를 따라 10 분 (마취 포함) 정도 소요됩니다. CSF 획득의 볼륨 마우스 변종에 따라 좌우됩니다. P301L (JNPL3) 마우스 3 10 μl - 15 μl의 수율을 제공하면서 2를 사용하여 PS / APP 더블 TG 생쥐에서 평균 거래량이 5 μl (3-7 μl)입니다. 시리얼 샘플링의 경우, 7-8 μl의 최대 안전 2~3개월의 간격으로 각각의 시간을 촬영하실 수 있습니다. 2. 수술하는 동안, 그것은 cisterna 마그나의 두라 메이터이 충분히 노출 수 있도록 stereotaxic 프레임에서 제대로 마우스의 머리와 신체를 위치하는 것이 중요합니다. ApoB 4 immunoblotting하여 CSF 샘플에서 모니터링할 수 있습니다 플라즈마 단백질에서 오염을 방지하기 위해 모세관으로 두라 메이터을 관통 때 신중하게 혈관을 피하십시오. 3. 조직의 교착은 다음 샘플링을 위해 predisposing 출혈로 어려움을 높일 수있는 각각의 수술시 조직 손상을 최소화하는 것이 중요합니다. 4. 마취로 인한 저체온증은 상당히 매우 빠르게 5 두뇌에 phosphorylated 타우 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에 체온이 잘 수술하는 동안 유지되어야합니다. 5. 우리가 사용하는 AB 엘리사 프로토콜과 항체는 Refolo 외에 자세히 설명했다. 6. 1:50-1:60 희석 때 PS / APP 생쥐에서 CSF의 두 μl는 만족스러운 결과를 줄 것이다. 타우 엘리사 들어, P301L (JNPL3) 생쥐 4-5 μl CSF는 충분합니다총 타우, 또는 타우의 검출 인광 물질은 트레오닌에서 ylated 231 (키트는 바이오 - 소스에서 구입). 6. 이 기술은 CSF의 작은 볼륨이 원하는 assays에 대해 만족하는 대한 신경 질환의 다른 마우스 모델에 적용할 수 있습니다.

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+Abeta42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).</li>
<li>Holcomb, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Alzheimer-type+phenotype+in+transgenic+mice+carrying+both+mutant+amyloid+precursor+protein+and+presenilin+1+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes.</a> Nat Med. 4, 97(1998).</li>
<li>Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibrillary+tangles%2C+amyotrophy+and+progressive+motor+disturbance+in+mice+expressing+mutant+%28P301L%29+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein.</a> Nat Genet. 25, 402- (2000).</li>
<li>DeMattos, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque-associated+disruption+of+CSF+and+plasma+amyloid-beta+%28Abeta%29+equilibrium+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurochem. 81, 229(2002).</li>
<li>Planel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+leads+to+tau+hyperphosphorylation+through+inhibition+of+phosphatase+activity+by+hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia.</a> J Neurosci. 27, 3090(2007).</li>
<li>Refolo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cholesterol-lowering+drug+reduces+beta-amyloid+pathology+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 8, 890(2001).</li>
</ol>

우리는 감지 플라즈마 오염없이 마우스에서 CSF의 시리얼 샘플링에 대한 신뢰성이 높은 프로토콜을 설명했다. 1. 전체 절차는 일반적으로 마우스를 따라 10 분 (마취 포함) 정도 소요됩니다. CSF 획득의 볼륨 마우스 변종에 따라 좌우됩니다. P301L (JNPL3) 마우스 3 μl - 15 10 μl의 수율을 제공하면서 우리가 used2 PS / APP 더블 TG 생쥐에서 평균 거래량이 5 μl (3-7 μl)입니다. 시리얼 샘플링의 경우, 7-8 μl의 최대 안전 2~3개월의 간격으로 각각의 시간을 촬영하실 수 있습니다. 2. 수술하는 동안, cisterna 마그나의 두라 메이터이 충분히 노출 수 있도록 stereotaxic 프레임에서 제대로 마우스의 머리와 신체를 위치하는 것이 중요합니다. ApoB 4 immunoblotting하여 CSF 샘플에서 모니터링할 수 있습니다 플라즈마 단백질에서 오염을 방지하기 위해 모세관으로 두라 메이터을 관통 때 신중하게 혈관을 피하십시오. 3. 조직의 교착은 다음...

cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

알츠하이머 병 (AD)는 병적 β - 아밀로이드 펩티드 (Aβ)와 hyperphosphorylated 타우 단백질의 세포외 intraneuronal 축적의 증착에 의해 특징 진보적인 neurodegenerative 질병입니다. 중추 신경계 (CSF)는 두뇌의 세포외 공간에 직접 접촉하기 때문에, 그것은 병적인 과정에 대한 응답으로 뇌의 생화학 변화의 반영을 제공합니다. 이러한 변화에 책임이있는 메커니즘이 아직 완전히 이해되지 않습니다하지만 AD 환자의 CSF는 42 아미노 산성 Aβ (Aβ42)의 형태, 총 타우와 타우 hy​​perphosphorylated 증가에서 감소를 보여줍니다. AD의 형질 (TG) 마우스 모델을 어떻게 그리고 왜 Aβ 또는 타우 수준 CSF의 변화에​​ 질병이 진행됨에 따라 조사에 좋은 기회를 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 CSF 샘플링을위한 세련된 cisterna 마그나 찔린 기법을 보여줍니다. 이것은 매우 부드러운 샘플링 기술은 시리얼 CSF 샘플이 크게 시간이 지남에 따라 미묘한 변경을 감지하는 것이 가능하게, Aβ 또는 타우 수준 사이 마우스 변화의 혼란함을 주죠 효과를 최소화 2~3개월 간격으로 같은 마우스에서 구할 수 있습니다. Aβ 및 타우 엘리사와 함께이 기술은 AD 마우스 모델에서 뇌의 CSF Aβ42과 타우의 수준 사이의 관계, 그들의 신진 대사를 조사하기위한 연구에 유용합니다. TG 생쥐의 연구 모니터링 질병 진행에 대한 생물 학적 마커로 사용할 수 CSF의 Aβ 또는 타우 수준의 잠재적으로 중요한 검증을 제공할 수있다, 그리고 치료 개입의 효과를 모니터합니다. 생쥐가 희생될 수 있고 두뇌가 생화학 또는 histological 변경 검사를 할 수 있듯이, CSF 변경 기본 메커니즘은 더 나은 평가하실 수 있습니다. 이 데이터는 인간의 광고 CSF 변경의 해석에 대한 정보를 수있다.

AD의 형질 (TG) 마우스 모델을 어떻게 그리고 왜 Aβ 또는 타우 수준 CSF의 변화에​​ 질병이 인간의 환자에서 진행됨에 따라 조사를 위해 좋은 기회를 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 시리얼 CSF 샘플링을위한 세련된 cisterna 마그나 찔린 기법을 보여줍니다.

Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

알츠하이머병(AD)은 병리학적으로 $\beta$-아밀로이드의 세포 외 침착과...으로 특징지어지는 진행성 신경퇴행성 질환입니다.

절차는 마우스 마취와 수술 부위 준비로 시작합니다. 그 후 마우스를 뇌정위 고정 장치 위에 복와위로 배치합니다. 후두골 하단 피부를 시상 방향으로 절개하고, 정중선을 따라 피하 조직과 목 근육을 둔성 박리합니다.그런 다음 몸의 후부를 내려 몸이 고정된 머리와 135도 각도를 이루게 하고, 유리 모세관으로 cisterna magna의 경막을 관통하여 CSF를 수집합니다. CSF 샘플링 후에는 근육을 다시 정렬하고 피부를 봉합하며, 탈수를 방지하기 위해 0.9% NaCl 식염수 약 1 mL를 피하 주사하고 마우스가 회복될 때까지 따뜻하게 유지합니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 The Top Institute의 Karen Duff 박사님 실험실 소속 Liu입니다.오늘은 마우스의 시스terna magna에서 뇌척수액을 채취하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 기술을 통해 동일한 마우스로부터 2~3개월 간격으로 최대 3회까지 연속적인 CSF 샘플을 채집할 수 있습니다. 저희 연구실에서는 알츠하이머병 형질전환 마우스 모델의 연령별 CSF Aβ 또는 tau 수치를 측정하고, 이 값들을 뇌의 수치와 상관 분석하는 데 이 기술을 사용하고 있습니다.마지막으로, 우리는 질병 진행 및 마우스 대상 치료 시험의 잠재적 생체 표지자로서 CSFA beta 또는 tau 수치의 가능성에 관심을 두고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 위해서는 마이크로 피펫 폴러를 사용하여 모세관을 제작해야 합니다.여기에 사용된 모세관은 Sutter Instruments 사의 BOA silicate glass B 175 10이며, 열 지수를 300으로, 압력 지수를 330으로 설정한 Sutter P 87 flaming micro pipette puller를 사용하여 당깁니다. 유리 모세관의 길이는 5 cm이며 끝부분이 테이퍼 형태로 가늘어집니다. 모세관의 팁은 가위로 다듬어 내경이 약 0.5 mm가 되도록 합니다.수술 절차는 케타민 100 mg/kg과 자일라진 10 mg/kg을 복강 내로 투여하여 마우스에게 마취를 실시하는 것으로 시작하며, 마취 동안에는 마우스를 37 °C 인큐베이터에서 따뜻하게 유지합니다. 발가락 꼬집기 반응(toe pinch withdrawal reflex)을 통해 동물이 완전히 마취되었음을 확인한 후, 목 부위의 털을 깎고 David Kink 사의 제품과 같은 뇌정위 고정 기구에 마우스를 배치합니다. 가열 패드와 직접 닿도록

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Joshi, K., et al. 생쥐의 Cisterna magna를 통해 꼬리 뇌간과 상부 경추 척수에 미세 주입하기 위한 정위 수술 접근법. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 뇌간과 상부 척수로의 표적 전달을 위한 수조 마그나 정위 접근법을 보여줍니다. 뇌척수액으로 채워진 수조 마그나에 접근함으로써 이 접근법은 표준 정위 고정 방법을 사용하여 도달하기 어려운 부위에 정밀하게 주사할 수 있습니다.

마우스 모델에서 치료 전달을 위한 정위 수조 마그나 접근법

출처: Zamboni, M., et al., induction of leptomeningeal cells modification by cisternal injection. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 유도 약물을 전달하는 절차를 보여줍니다. 주사는 형광 영상으로 확인된 뇌척수액을 통해 접근할 수 있는 뇌 표면 세포에서 형광 마커 발현을 선택적으로 유도합니다.

Cisterna Magna Injection을 통한 마우스 모델의 표적 약물 전달

출처: Xavier, ALR, et al. 설치류의 수조 마그나에 캐뉼라 이식. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 캐뉼라를 이식하는 절차를 보여줍니다. 이 기술은 바늘에 장착된 캐뉼라를 경막을 통해 거꾸로 된 삼각형 수조 대나로 안내하고 뇌척수액으로 표적으로 전달하기 위해 고정하는 것입니다.

마우스 모델에서 Cisterna Magna에 캐뉼라 이식

이 비디오에서는 인간 유래 종양 세포를 쥐 뇌의 수조 마그나로 전달하는 절차를 설명합니다. 정소성 마우스 모델은 두개골 수막으로의 암의 전이성 확산을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

외과적 수조 마그나 주사: 쥐 모델의 중추 신경계에 종양 세포를 직접 투여하는 방법

출처: Sweeney, AM, et al. 형광 거시경을 이용한 온전한 마우스 두개골을 통한 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징. J. Vis. Exp. (2019) 이 비디오는 형광 영상을 사용하여 마우스 뇌의 뇌척수액(CSF) 흐름을 시각화하는 과정을 보여줍니다. 형광 추적자를 수조 마그나(CM)에 주입하여 지주막하 및 혈관주위 공간을 통해 CSF와의 움직임을 추적할 수 있습니다. 타임랩스 이미징은 추적자의 여정을 포착하여 세동맥을 통해 뇌 조직으로의 분포를 강조합니다.

형광 거시경을 이용한 마우스 뇌에서 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

이 프로토콜에는 혈액에서 오염 없이와 뇌 척추 액체 (CSF)의 풍부한 컬렉션에 대 한 향상 된 기술을 설명합니다. 큰 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석 두뇌 및 척수에 영향을 질병의 우리의 이해를 추가 CSF를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

여기는 시스테 마그나 cannulation (CMc), 뇌 척추 액체 (CSF)에 추적기, 기판 및 신호 분자를 제공 하는 최소 침 습 방법을 수행 하는 프로토콜에 설명 합니다. 다른 이미지 형식으로 결합, CMc glymphatic 시스템 및 CSF 역학 평가 뿐만 아니라 다양 한 화합물의 두뇌 전체 배달 수 있습니다.

설치류의 시스테 마그나에 정 맥 주입

경두개 광학 화상 진찰은 온전한 두개골을 통해 살아있는 마우스의 피질에 있는 뇌척수액 수송의 광시야 화상 진찰을 허용합니다.

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

높은 척수액 단백질 수준은 변경된 혈액 뇌 장벽 또는 신분 합성을 통해 혈장 단백질의 확산의 결과일 수 있습니다. 최적화된 테스트 프로토콜은 두 경우를 모두 구별하는 데 도움이 되며 합성된 단백질의 정량적 측정을 제공하는 이 문서에 제시되어 있습니다.

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

생쥐의 뇌 부위를 표적으로 삼는 입체 택시 수술은 일반적으로 두개골 뼈를 통한 접근을 포함하며 두개골 랜드 마크에 의해 안내됩니다. 여기서 우리는 뇌간 랜드 마크의 직접적인 시각화에 의존하는 cisterna magna를 통해 꼬리 뇌간과 상부 자궁 경부 척수를 목표로하는 대체 입체 택시 접근법을 개략적으로 설명합니다.

마우스의 Cisterna Magna를 통해 Caudal Brainstem과 Upper Cervical Spinal Spind를 미세 주입하는 입체 택시 외과 적 접근법

여기서는 여러 신경학적 질환에서 중요한 역할을 하는 마우스 수막 림프관(MLVs)을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목표는 추적자 배수의 기능적 평가와 등쪽 MLVs 네트워크의 상세한 형태학적 특성화를 모두 가능하게 하는 통합 방법을 제공하는 것입니다.

수막 림프관 평가를 위한 통합 프로토콜: 흉부 주사, 림프절 영상, 수막 박리, 전면 착색

학습하세요 마우스 뇌척수액 직렬 채취 기법을 통해 알츠하이머병 바이오마커 Aβ와 tau 수치를 정밀 측정하는 방법을. 이 기술은 동일 마우스에서 반복 샘플링이 가능하여 질병 진행을 장기적으로 추적할 수 있습니다.

Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

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