쥐 우수한 자궁암 신경 (SCG)에서 Culturing 교감 신경에 대한 프로토콜

이 절차는 P zero 신생 쥐로부터 상경신경절을 분리하는 것으로 시작합니다. 각 뇌에는 두 개의 상경신경절이 있습니다. 쥐 한 배의 새끼들로부터 약 24개의 신경절을 수확할 수 있습니다.

신경절의 해리는 30분간의 처리와 트리psin 처리를 통해 시작됩니다. 이후 화염 처리한 파스퇴르 피펫으로 반복적으로 반응시켜 단일 세포 현탁액을 만들어 추가적인 해리를 수행합니다. 그 후 교감신경 뉴런을 콜라겐 ENC 코팅 접시에 도말합니다.

안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 도시 캠퍼스 병리학 및 세포 생물학과의 Lloyd Green 박사님 연구실 소속 Nila Zurin입니다. 오늘은 갓 태어난 붉은 쥐의 상경신경절에서 1차 교감신경 뉴런을 분리하고 배양하는 방법을 시연하겠습니다. 저희 연구실에서는 일반적으로 신경성장인자 제거에 따른 세포 사멸을 연구하기 위해 이 세포들을 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 해부를 수행하기 24시간 전에 배양 접시를 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅하는 것으로 절차를 시작합니다. 실험의 성격에 따라 24웰 또는 48웰 배양 플레이트를 사용합니다.

다음으로 솔루션 배지와 장비를 준비합니다. 이러한 재료와 시약은 이 비디오에 포함된 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. uridine 및 5-FDU 솔루션은 사용 직전에 제조해야 한다는 점에 유의하십시오.

화염을 이용하여 준비 과정을 계속합니다. 분주 단계에 사용할 유리 파스퇴르 피펫을 성형합니다. 유리 피펫의 끝부분을 회전시키면서 화염에 몇 초 동안 가열하여 좁고 매끄럽게 만듭니다.

초기 화염 멸균은 멸균된 세포 배양 후드 내에서 수행해야 합니다. 해부를 시작하기 위해 P0에서 P1 단계의 신생 쥐 새끼를 준비합니다. 오염을 줄이기 위해 신생 쥐 새끼의 표면을 70% ethanol로 빠르게 닦아냅니다.

머리를 절단한 후, 배면이 위를 향하게 하고 꼬리 쪽이 사용자 방향을 향하도록 하여 해부 패드 위에 놓습니다. 절단된 기관(trachea)이 쉽게 보여야 합니다. 멸균 주사바늘을 사용하여 다음과 같은 방법으로 절단된 머리를 해부 패드에 고정합니다.

핀 하나를 입천장을 통해 패드에 고정하고, 두 번째 핀을 절단된 척수를 통해 패드에 고정합니다. 해부 패드를 현미경 아래로 옮겨 접안렌즈로 관찰하면서, 두 개의 포셉을 사용하여 기관 주변의 피부와 지방을 제거합니다. 너무 깊게 들어가지 않도록 주의하면, 기관의 양측에서 서로 거의 평행하게 달리는 한 쌍의 근육이 노출됩니다.

해부 과정 중에 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 차가운 멸균 PBS 또는 차가운 무혈청 RPMI 1640 배지로 세척하여 과도한 혈액을 씻어내야 합니다. 이는 작업 속도에 따라 한 번 또는 그 이상 반복하여 수행할 수 있습니다. 그 후 핀셋을 사용하여 먼저 한쪽의 근육을 절개하고 제거합니다.

근육을 제거하면 경동맥이 보일 것입니다. 이 동맥은 기관을 따라 주행하며 Y자형 리본 모양으로 분지합니다. 이 분지 지점은 중요한 지표가 되며, 일단 이 위치를 찾으면 상경신경절을 비교적 쉽게 찾을 수 있습니다.

동맥의 가장 말단 부위를 절단하고 핀셋으로 약간 들어 올립니다. 동맥의 반대쪽 끝은 부착된 상태로 유지합니다. 이 과정이 완료되면 상경신경절이 보이게 됩니다.

분지점의 동맥에 느슨하게 부착된 아몬드 모양의 광택이 나는 작은 조직 덩어리가 보이며, 실 모양의 신경절 전 또는 후 연결망이 있음을 확인해야 합니다. 두 번째 핀셋을 사용하여 상경신경절을 조심스럽게 분리한 후, 차가운 무혈청 RPMI 1640 배지가 담긴 작은 35 millimeter 배양 접시에 넣습니다. 다음으로, 동일한 프로토콜에 따라 기관의 반대편에 있는 신경절을 추출합니다.

모든 신경절의 해부가 완료되면, 외부 조직을 최대한 제거하여 분리합니다. 현미경으로 관찰하면 신경절에 경동맥 지방이나 기타 조직 조각들이 붙어 있는 것을 확인할 수 있는데, 이때 핀셋을 사용하여 이러한 불필요한 물질들을 떼어냅니다. 신경절 전 및 후의 연결근(connectives) 또한 절단하여 제거합니다.

각 신경절에는 약 10,000개의 뉴런이 있습니다. 뉴런을 도말하면, 뉴런의 돌기가 다시 성장하게 됩니다. 그 후 신경절을 RPMI 1640 배지가 들어 있는 멸균된 15 milliliter 원추형 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다.

다음으로 교감 신경세포 배양을 수행합니다. 신경절을 200 G에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 신경절을 0.25% trypsin 용액 0.5~1 mL에 다시 현탁한 후, 37 °C 항온수조 또는 인큐베이터에 30분 동안 두어 신경절 내의 세포들이 해리되도록 돕습니다.

30분 후, 트립신을 희석하고 중화시키기 위해 10 milliliters의 완전 배지를 첨가합니다. 그 후 용액을 200 G에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 신경절을 2 milliliters의 최종 배지에 재현탁합니다.

입구가 넓은 미리 준비된 화염 연마 피펫 팁을 사용하여, 신경절을 20회 정도 위아래로 움직여 세포를 더욱 해리시킵니다. 그런 다음 튜브를 몇 분 동안 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 피펫 입구를 더욱 좁게 만들기 위해 피펫을 다시 한번 화염 연마합니다.

피펫이 식은 후, 신경절을 20회 더 분쇄합니다. 배지가 점차 탁해지는데, 이는 세포가 해리되고 있음을 나타냅니다. 세포의 해리 정도에 따라 이 단계를 한두 번 더 반복합니다.

시간이 지나면 신경절이 뉴런으로 해리되어 튜브 내에 온전한 신경절이 보이지 않게 됩니다. 이 시점에서 해리되지 않는 일부 조직 물질이 남아 있을 수 있습니다. 해리되지 않은 잔해물이 바닥으로 가라앉을 수 있도록 튜브를 얼음 위에 몇 분 동안 그대로 둡니다.

상층액 중 약 50 µL를 제외한 나머지를 조심스럽게 수집하여 다른 튜브에 옮깁니다. 결합되지 않은 잔해물이 함께 옮겨지는 것을 방지하기 위해 튜브 바닥에 50 µL를 남겨둡니다. 분리된 세포가 들어 있는 튜브에 최종 배지를 더 추가합니다.

최종 배지의 첨가 부피는 배양 플레이트의 종류에 따라 다릅니다. 하나는 뉴런을 배양하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 24-well dish를 사용하는 경우, 웰당 0.5 milliliters의 최종 배지와 함께 웰당 하나의 신경절을 플레이팅하십시오.

일반적인 쥐 한 배의 새끼는 12마리로, 이를 통해 24개의 신경절을 얻을 수 있습니다. 이는 24-well 플레이트 1개를 채우기에 충분한 양이며, 최종 배지의 총 부피는 12 milliliters입니다. 최종 배지에 uridine five FDU를 사용하면 소수의 글리아 및 기타 세포 유형의 증식을 억제하고 사멸을 촉진할 수 있습니다.

배양액 내의 세포에는 48시간마다 배지의 2/3를 교체하여 영양분을 공급합니다. 이때 신선한 RPMI에 1% horse serum, NGF, uridine 및 5 FDU를 첨가합니다. 초기 배양 시에는 신경세포가 없는 둥근 형태의 교감신경 뉴런들이 관찰됩니다.

짧은 뉴런들은 해부 24시간 후에 보이기 시작하며, 시간이 지남에 따라 점차 밀도가 높아지고 더 많이 분지됩니다. 지금까지 신생 쥐의 상경신경절에서 일차 교감신경 뉴런을 분리하고 배양하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 첫째, 시간을 갖고 세심하게 신경절을 세척하여 모든 잔해와 혈관, 지방을 제거하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이 단계는 배양이 어느 정도 균질하며 다른 세포 유형이 섞이지 않도록 보장하는 데 중요합니다. 둘째로, 해리 단계에서는 인내심을 갖고 시간을 들여 뉴런을 분리함으로써 커다란 덩어리로 뭉쳐 있지 않게 해야 합니다. 일단 플레이트에 안착되면, 큰 덩어리들은 작업에 어려움을 줄 수 있습니다.

뉴런을 절단하거나 감염시키는 것과 같은 하위 응용 단계에서 면역 염색이 방해받을 수 있으며, 뉴런 수를 세어야 하는 모든 실험 또한 수행하기 어려워질 것입니다. 마지막으로, 배지에 페니실린-스트렙토마이신을 추가로 보충할 필요는 없습니다. 배양액에 페니실린-스트렙토마이신을 추가할 때, 세포를 처음으로 플레이팅할 때만으로도 충분합니다.

배지를 교체할 때마다 신선한 uridine five FDU를 배지에 추가하십시오. 저희 연구실에서는 신경 성장 인자 결핍에 반응하는 세포 사멸을 연구하기 위해 교감 신경세포 배양을 이용해 왔습니다. 이것으로 모두 끝났습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.