Name: 쥐 우수한 자궁암 신경 (SCG)에서 Culturing 교감 신경에 대한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 배우세요 신생 쥐의 상경부 교감신경절에서 일차 교감신경을 분리하고 배양하는 방법을. 효소 처리와 기계적 분해로 단일 세포 현탁액을 얻어 콜라겐 코팅 배지에 도금합니다. 이 기법은 신경생물학 및 세포 생물학 연구에 필수적인 기초 기술을 제공합니다.

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NZ, 동정 뉴런을 해부하고 수확에서 그녀를 훈련 연구소 회원 Subhas Biswas, 앤드류 스프 라울, 그리고 라이언 윌렛 감사하고 싶습니다. NIH - NINDS에서 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 해부를위한 준비 : <ol><li> 적절한 문화 실험의 성격에 따라 접시 (10cm 또는 6 - 글쎄 또는 24 - 잘 접시 등) 및 외투들을 쥐 - 꼬리 콜라겐 24시간 절개 전에로를 선택합니다. 쥐 - 꼬리 콜라겐을 준비하고 외투 문화 요리에 사용하기위한 방법은 (1) 다른 설명했습니다. </li><li> 인산염의 0.25 % 트립신의 솔루션을 준비 호수 (PBS) (없음 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))와 필터 소독이 버퍼. -20 º C. 1 ML aliquots 및 상점 준비 </li><li> 소주 / deionized H 2 O. 2.5 MM 유리딘 각각 5 - FDU를 포함하는 솔루션을 준비 필터 - 소독 50 μl aliquots를 준비합니다. -20 º C.에 저장 </li><li> 10 %의 열 inactivated 말 혈청 (열 30 분 56 º C waterbath의 잠복기에 의해 inactivate)와 5% 태아 소 혈청과 RPMI 1640 배지 : 완전한 매체를 준비합니다. </li><li> 최종 중간 준비 : 1 %의 열 inactivated 말 혈청 + NGF (100ηg/ml 최종 농도) + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 / 250) + 250분의 1 uridine/5-FDU 솔루션 RPMI 1640 배지 (10 μm의 최종 농도) . 참고 : 매번 사용하기 전에이 매체는 신선한까지하여야한다. 24 웰 플레이트 형식의 실험, 이러한 매체 12 ML 준비를해야합니다. 그것은 당신이 약간 여분을 준비하는 것이 좋습니다. NGF는 상업 다양한 소스 (이 프로토콜의 끝에 표 참조)에서 구입할 수 있습니다. </li><li> 장비 : 하나는 해부 현미경과 광원이 필요합니다. 초점 팁을 듀얼 구스넥 광섬유 조명기을 선호합니다. 스테인레스 포셉을 마이크로는 - 해부 두 켤레와 해부 가위 (또한 스테인레스 스틸 : 또한, 하나는 (autoclaving 또는 최소한 20 분 동안 70 %의 에탄올에 몸을 담글 수로) 다음과 같은 해부 도구를 청소하고 소독해야합니다 그리고 Roboz에서 모두). 두 무균 주사기 바늘은 (26 gague X 1 ½ 인치 또는 이와 유사한 것)도 필요합니다. 그것은 알루미늄 호일에 싸여 Kimwipe으로 덮여 스티로폼의 3 &quot;X3&quot;조각 해부 보드를 설정하는 것이 필요합니다. 오염을 제거하다 70 %의 에탄올과 보드를 스프레이. 마지막으로, 불타는 광택 유리 파스투레 피펫을 준비합니다. 회전하는 동안 화재 - 폴란드어하기 위해, 유리 피펫을 가지고 몇 초 동안 불꽃의 팁을시오. 검사시 팁은 매끄러운 모양과 개방이 좁아 것입니다. 이것은 세포가 dissociated 될 단계가 필요합니다. 피펫은 멸균 남아 있도록 세포 배양 후드에 불을 연마를 수행합니다. </li></ol> 2. 우수한 자궁암 신경의 해부 : <ol><li> 연령 P0 또는 P1의 아르 신생아 쥐의 새끼를 수집합니다. </li><li> 신속하게 오염의 가능성을 줄이기 위해 70 %의 에탄올과 해부를위한 강아지를 닦아냅니다. </li><li> 신속하게 가위 날카로운 쌍 (이 단계는 동영상에 표시되지 않습니다)와 새끼 목을 베다. 간단히 초과 혈액을 유출하기 위해 멸균 거즈에 대한 살균 집게를 사용하여 머리를 잡아. </li><li> 최대 직면하고있는 복부 측면과 당신을 향한 지향 꼬리 끝에있는 해부 패드에 머리를 놓으십시오. 절단 기관은 쉽게 볼 수 있습니다. 패드에 입천장하지만 한 핀을 밀어와 패드로 절단기도하지만 두 번째 핀을 눌러 다음 방법으로 해부 패드로 잘린 머리를 확보하기 위해 멸균 주사기의 바늘을 사용합니다. 해부 현미경으로 패드를 장소와 절개를 시작합니다. </li><li> 두 포셉 (각 손에 한)기도 주위 치워 피부와 지방을 사용하여 너무 깊이 가지 않도록주의한다. 이렇게하면 기관의 양쪽에 서로 거의 평행 실행 근육의 한 켤레를 노출합니다. 참고 : 해부하는 동안, 당신이 추위 멸균 PBS 또는 추위, 과도한 혈액을 멀리 세척하고 지역 깨끗하고 촉촉한 유지 살균, 파스퇴르 피펫과 함께 제공되는 혈청 무료 RPMI 1640 배지와 관개해야합니다. 이것은에 따라 단 한 번 이상 할 수 있습니다 얼마나 빠른 걸로 작동합니다. 경험 해부학자 들어, 신경 한 켤레를 해부하다에만 대해 두 3 분 걸립니다. </li><li> 첫 번째 측면에있는 근육을 절단하고 제거하는 포셉을 사용합니다. </li><li> 근육이 제거되면, 경동맥이 표시됩니다. 종종 그것은 밝은 분홍빛이 도는하고 혈액을 포함하고 있습니다. 그것은 당신이 주변에서 볼 수있는 다른 혈관보다 색상의 가벼운 나타날 수 있으며 이런 이유 경동맥 바로 눈에 띄지 않을 수도 있습니다. 이 동맥은 &quot;Y&quot;모양의 리본 생겼는지으로기도와 bifurcates 함께 실행됩니다. 이 분기점은 중요한 이정표이며이있는 한, 그것은 SCG를 찾을 상대적으로 쉽게됩니다. </li><li> 가장 꼬리 끝에있는 동맥을 끊어와 포셉 (상대방이 여전히 연결된)를 약간 들어올려. 일단 이렇게, 당신은 thr 느슨하게 단지 분기점의 시점에서 동맥에 붙어 있으며 조직의 아몬드 모양, 광택 찾고 작은 질량을 가지고 볼 수 있습니다사전 및 / 또는 사후 ganglionic connectives EAD 같은. 이것은 우수한 경추 신경절이다. 부드럽게 감기, 혈청 무료 RPMI 1640 매체를 포함하는 작은 문화 요리 (35 ㎜)에과 장소를 분리하는 반면에 포셉의 두 번째 쌍을 사용합니다. </li><li> 다음, 같은 프로토콜을 다음과 같은 기관의 다른 측면에 신경을 압축을 풉니다. </li></ol> 3. 신경 청소 : <ol><li> 일단 모든 신경이 밖으로 해부되었습니다, 그들은 최대한 관계없는 조직을 해제해야합니다. </li><li> 해부 현미경 아래에서, 당신은 신경이 경동맥, FAT 또는 기타 조직의 조각을 첨부 것을 볼 수 있습니다. 이러한 불필요한 물질을 멀리 애타게 각 손에 집게와 함께 작동합니다. 장소는 RPMI 1640 매체를 포함, 살균 15ml 원뿔, 폴리 프로필렌 튜브에 신경을 청소. </li><li> 사전 및 / 또는 사후 ganglionic connectives도 멀리 줄어들 수 있습니다. 각 신경절은 약 1 만 뉴런 있습니다. 뉴런은 도금되면, 그들은 neurites를 regrow 것입니다. </li></ol> 4. 교감 신경의 문화를 구축 : <ol><li> 이분에 대한 200xg에 신경을 원심과 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 0.25 %의 트립신 솔루션의 0.5-1 ML에 신경을 Resuspend. 30 분 37 ˚ C waterbath이나 보육에 놓습니다. 이것은 신경의 세포를 떼어 놓다 도움이 될 것입니다. </li><li> 30 분 후에 밖으로 희석 2 분 200xg에서 트립신과 원심 분리기를 무력화하기 위해 완전한 중간의 10 ML를 추가합니다. </li><li> 뜨는 최종 중간 2 ML에 resuspend 폐기하십시오. </li><li> 더욱 불을 광택 유리 파스투레 피펫으로 신경을 위아래 triturating하여 세포를 떼어 놓다. 신경 20 번 씹다하고 몇 분 동안 얼음에 튜브를 놓으십시오. </li><li> 한편, (약 3분의 2 1 / 2mm 지름) 자리가 좁아하기 위해 더 많은 화재 - 폴란드어 피펫. 그것이 냉각까지 몇 분 기다려 20 배 더 신경을 씹다. 계속으로, 매체는 점차적으로 cloudier 세포 dissociated되고있다는 것을 나타내는 될 것입니다. 한 두 번 더 세포 분열시키다 얼마나 잘에 따라이 단계를 반복합니다. 시간 후, 당신은 모든 신경은 뉴런에 dissociated하고 더 완전한 신경은 튜브에서 볼 수없는 것을 통지합니다. 교제를 끊다되지 않습니다 일부 조직 물질이있을 수 있습니다. 이 시점에서 어떤 undissociated 파편이 바닥에 해결 할 수 있도록 튜브가 몇 분 동안 얼음에 앉아 보자. 이제 조심스럽게 다른 튜브에서 최고의 장소에서 거의 모든 매체를 수집합니다. 당신이 undissociated 파편을 수집하지 않도록하기 위해 튜브의 하단에있는 약 50 μl를 떠나. dissociated 세포를 포함하는 튜브에 최종 매체를 더 추가 :이 볼륨 문화 플레이트 하나가 문화에 신경을 사용하는의 종류에 따라 다릅니다. 예를 들면 다음과 같습니다 잘 따라 최종 매체의 0.5 ML에 잘 당 24 잘 요리가 직업이있다면, 그때 플레이트 0.5 신경 (물론 당 ~ 10,000 뉴런). 전형적인 쥐 쓰레기는 24 신경 줄 래요 12 새끼,로 구성되어 있습니다. 이 종자 일 24 잘 플레이트 및 최종 중간의 총 부피 12 ML입니다 충분하다. 참고 : 신경이 문화에 제공됩니다 glia와 다른 세포 유형의 작은 인구에도 포함되어 있습니다. 최종 매체 Uridine/5-FDU를 사용하면 자신의 확산을 방지하고 그들의 죽음을 촉진합니다. </li><li> 피드 세포 신선한 RPMI 1퍼센트 말 혈청 + NGF와 uridine/5-FDU과 함께 매체의 2 / 3를 대체하여 모든 48시간. 참고 : 처음에는 문화가없이 neurites와 둥근 모양 교감 신경이 포함되어 있습니다. 짧은 neurites는 절개 후 보이는 24 시간이되고 점차적으로 밀도가 더 시간이 지남에 따라 분기가됩니다. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
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<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
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<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

저자들은 공개할 이해관계가 없음을 밝힙니다.

우리는 우리의 문화 스프 라그 돌리 쥐를 사용합니다. 신경 청소 때 시간과주의를 가져가라. 모든 파편, 혈관과 지방을 제거합니다. 이 단계는 더 많거나 적은 균일한과 관계없는 세포 종류의 무료 문화 확보에 중요합니다. uridine/5-FDU의 추가는 크게 문화를 오염 나머지 (mitotic) 이외의 연결을 세포를 제거하거나 적어도 증식을 억제합니다. 또한, 분리 단계 동안 인내심을하고는 접시에 씨앗되면 그들이 큰 대단히 짧은 시간에 발견되지 않도록 신경을 분리하는 시간을 가지십시오. 세포 큰 대단히 짧은 시간을 갖는 것은 좋은 실험 결과를 얻을 수 없습니다. 예를 들어, 대형 대단히 짧은 어려운 뉴런이 transfected 또는 감염 될 수 있도록합니다. Immunostaining도 방해 할 수 있으며 뉴런을 계산 필요한 모든 실험뿐만 아니라, 수행하기 어려울 것입니다. 그것은 문화가 공급 아르 펜 / strep 모든 시간과 매체를 보완하기 위해 필요는 없습니다. 세포 도금 아르 펜 / strep 첫번째 시간 또한 충분...

<table><tbody><tr><td>포셉, 스테인리스강 #5</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>가위, DEAVER 직선형 sharp-blunt - 43mm 날 - 5.5</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 w/ L-Glutamin</td><td>시약</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>소태아혈청</td><td>시약</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>공여마혈청</td><td>시약</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>56&amp;#x00B0;C 항온수조에서 30분 동안 배양하여 열 불활성화함.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free 트립신</td><td>시약</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>유리딘</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; deoxyuridine</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>시약</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>해부현미경 및 광원</td><td>현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 폴리프로필렌 튜브</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>도구</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 우수한 자궁암 신경 (scg)에서 culturing 교감 신경에 대한 프로토콜

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

쥐에서 우수 자궁 경부 신경 (SCG)은 교감 신경을 포함 작은 광택, 아몬드 모양의 구조입니다. 이들 뉴런은 머리와 목 지역에 대한 공감 innervations를 제공하고 그들은 잘 특징과 비교적 균질 인구 (4) 구성합니다. 교감 신경이 NGF의 가용성은 그들의 문화와 실험 조작 (2, 3, 6)을 용이하게 생존, 분화 및 axonal 성장과 넓은 확산에 대한 신경 성장 인자 (NGF)에 따라 달라집니다. 이러한 이유로, 교양 교감 신경이의 연결을 개발 및 분화, 프로그램 및 병리 학적 세포 죽음의 메커니즘 및 신호 전달 (1, 2, 5, 6)를 포함하여 연구의 다양한 사용되었습니다. 신생아 쥐 및 culturing 교감 신경에서 SCG를 해부하는 것은 매우 복잡하지 않으며 매우 빠르게 마스터하실 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 신생아 쥐 새끼에서 SCG을 해부하다하고 교감 신경의 문화를 확립하기 위해 그들을 사용하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 문서는 또한 준비 단계와이를하는 데 필요한 다양한 시약과 장비를 설명합니다.

이것은 갓 태어난 새끼 쥐의 우수한 경추 신경 (SCG)에서 기본 교감 신경을 분리하고 문화하는 방법을 설명하는 프로토콜입니다.

쥐 우수한 자궁암 신경 (SCG)에서 Culturing 교감 신경에 대한 프로토콜

쥐의 상경신경절(superior cervical ganglia, SCG)은 교감신경 뉴런을 포함하는 작고 광택이 나는 아몬드 모양의 구조물입니다. 이 뉴런들은 ...

이 절차는 P zero 신생 쥐로부터 상경신경절을 분리하는 것으로 시작합니다. 각 뇌에는 두 개의 상경신경절이 있습니다. 쥐 한 배의 새끼들로부터 약 24개의 신경절을 수확할 수 있습니다.신경절의 해리는 30분간의 처리와 트리psin 처리를 통해 시작됩니다. 이후 화염 처리한 파스퇴르 피펫으로 반복적으로 반응시켜 단일 세포 현탁액을 만들어 추가적인 해리를 수행합니다. 그 후 교감신경 뉴런을 콜라겐 ENC 코팅 접시에 도말합니다.안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 도시 캠퍼스 병리학 및 세포 생물학과의 Lloyd Green 박사님 연구실 소속 Nila Zurin입니다. 오늘은 갓 태어난 붉은 쥐의 상경신경절에서 1차 교감신경 뉴런을 분리하고 배양하는 방법을 시연하겠습니다. 저희 연구실에서는 일반적으로 신경성장인자 제거에 따른 세포 사멸을 연구하기 위해 이 세포들을 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 해부를 수행하기 24시간 전에 배양 접시를 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅하는 것으로 절차를 시작합니다. 실험의 성격에 따라 24웰 또는 48웰 배양 플레이트를 사용합니다.다음으로 솔루션 배지와 장비를 준비합니다. 이러한 재료와 시약은 이 비디오에 포함된 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. uridine 및 5-FDU 솔루션은 사용 직전에 제조해야 한다는 점에 유의하십시오.화염을 이용하여 준비 과정을 계속합니다. 분주 단계에 사용할 유리 파스퇴르 피펫을 성형합니다. 유리 피펫의 끝부분을 회전시키면서 화염에 몇 초 동안 가열하여 좁고 매끄럽게 만듭니다.초기 화염 멸균은 멸균된 세포 배양 후드 내에서 수행해야 합니다. 해부를 시작하기 위해 P0에서 P1 단계의 신생 쥐 새끼를 준비합니다. 오염을 줄이기 위해 신생 쥐 새끼의 표면을 70% ethanol로 빠르게 닦아냅니다.머리를 절단한 후, 배면이 위를 향하게 하고 꼬리 쪽이 사용자 방향을 향하도록 하여 해부 패드 위에 놓습니다. 절단된 기관(trachea)이 쉽게 보여야 합니다. 멸균 주사바늘을 사용하여 다음과 같은 방법으로 절단된 머리를 해부 패드에 고정합니다.핀 하나를 입천장을 통해 패드에 고정하고, 두 번째 핀을 절단된 척수를 통해 패드에 고정합니다. 해부 패드를 현미경 아래로 옮겨 접안렌즈로 관찰하면서, 두 개의 포셉을 사용하여 기관 주변의 피부와 지방을 제거합니다. 너무 깊게 들어가지 않도록 주의하면, 기관의 양측에서 서로 거의 평행하게 달리는 한 쌍의 근육이 노출됩니다.해부 과정 중에 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 차가운 멸균 PBS 또는 차가운 무혈청 RPMI 1640 배지로 세척하여 과도한 혈액을 씻어내야 합니다. 이는 작업 속도에 따라 한 번 또는 그 이상 반복하여 수행할 수 있습니다. 그 후 핀셋을 사용하여 먼저 한쪽의 근육을 절개하고 제거합니다.근육을 제거하면 경동맥이 보일 것입니다. 이 동맥은 기관을 따라 주행하며 Y자형 리본 모양으로 분지합니다. 이 분지 지점은 중요한 지표가 되며, 일단 이 위치를 찾으면 상경신경절을 비교적 쉽게 찾을 수 있습니다.동맥의 가장 말단 부위를 절단하고 핀셋으로 약간 들어 올립니다. 동맥의 반대쪽 끝은 부착된 상태로 유지합니다. 이 과정이 완료되면 상경신경절이 보이게 됩니다.분지점의 동맥에 느슨하게 부착된 아몬드 모양의 광택이 나는 작은 조직 덩어리가 보이며, 실 모양의 신경절 전 또는 후 연결망이 있음을 확인해야 합니다. 두 번째 핀셋을 사용하여 상경신경절을 조심스럽게 분리한 후, 차가운 무혈청 RPMI 1640 배지가 담긴 작은 35 millimeter 배양 접시에 넣습니다. 다음으로, 동일한 프로토콜에 따라 기관의 반대편에 있는 신경절을 추출합니다.모든 신경절의 해부가 완료되면, 외부 조직을 최대한 제거하여 분리합니다. 현미경으로 관찰하면 신경절에 경동맥 지방이나 기타 조직 조각들이 붙어 있는 것을 확인할 수 있는데, 이때 핀셋을 사용하여 이러한 불필요한 물질들을 떼어냅니다. 신경절 전 및 후의 연결근(connectives) 또한 절단하여 제거합니다.각 신경절에는 약 10,000개의 뉴런이 있습니다. 뉴런을 도말하면, 뉴런의 돌기가 다시 성장하게 됩니다. 그 후 신경절을 RPMI 1640 배지가 들어 있는 멸균된 15 milliliter 원추형 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다.다음으로 교감 신경세포 배양을 수행합니다. 신경절을 200 G에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 신경절을 0.25% trypsin 용액 0.5~1 mL에 다시 현탁한 후, 37 °C 항온수조 또는 인큐베이터에 30분 동안 두어 신경절 내의 세포들이 해리되도록 돕습니다.30분 후, 트립신을 희석하고 중화시키기 위해 10 milliliters의 완전 배지를 첨가합니다. 그 후 용액을 200 G에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 신경절을 2 milliliters의 최종 배지에 재현탁합니다.입구가 넓은 미리 준비된 화염 연마 피펫 팁을 사용하여, 신경절을 20회 정도 위아래로 움직여 세포를 더욱 해리시킵니다. 그런 다음 튜브를 몇 분 동안 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 피펫 입구를 더욱 좁게 만들기 위해 피펫을 다시 한번 화염 연마합니다.피펫이 식은 후, 신경절을 20회 더 분쇄합니다. 배지가 점차 탁해지는데, 이는 세포가 해리되고 있음을 나타냅니다. 세포의 해리 정도에 따라 이 단계를 한두 번 더 반복합니다.시간이 지나면 신경절이 뉴런으로 해리되어 튜브 내에 온전한 신경절이 보이지 않게 됩니다. 이 시점에서 해리되지 않는 일부 조직 물질이 남아 있을 수 있습니다. 해리되지 않은 잔해물이 바닥으로 가라앉을 수 있도록 튜브를 얼음 위에 몇 분 동안 그대로 둡니다.상층액 중 약 50 µL를 제외한 나머지를 조심스럽게 수집하여 다른 튜브에 옮깁니다. 결합되지 않은 잔해물이 함께 옮겨지는 것을 방지하기 위해 튜브 바닥에 50 µL를 남겨둡니다. 분리된 세포가 들어 있는 튜브에 최종 배지를 더 추가합니다.최종 배지의 첨가 부피는 배양 플레이트의 종류에 따라 다릅니다. 하나는 뉴런을 배양하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 24-well dish를 사용하는 경우, 웰당 0.5 milliliters의 최종 배지와 함께 웰당 하나의 신경절을 플레이팅하십시오.일반적인 쥐 한 배의 새끼는 12마리로, 이를 통해 24개의 신경절을 얻을 수 있습니다. 이는 24-well 플레이트 1개를 채우기에 충분한 양이며, 최종 배지의 총 부피는 12 milliliters입니다. 최종 배지에 uridine five FDU를 사용하면 소수의 글리아 및 기타 세포 유형의 증식을 억제하고 사멸을 촉진할 수 있습니다.배양액 내의 세포에는 48시간마다 배지의 2/3를 교체하여 영양분을 공급합니다. 이때 신선한 RPMI에 1% horse serum, NGF, uridine 및 5 FDU를 첨가합니다. 초기 배양 시에는 신경세포가 없는 둥근 형태의 교감신경 뉴런들이 관찰됩니다.짧은 뉴런들은 해부 24시간 후에 보이기 시작하며, 시간이 지남에 따라 점차 밀도가 높아지고 더 많이 분지됩니다. 지금까지 신생 쥐의 상경신경절에서 일차 교감신경 뉴런을 분리하고 배양하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 첫째, 시간을 갖고 세심하게 신경절을 세척하여 모든 잔해와 혈관, 지방을 제거하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이 단계는 배양이 어느 정도 균질하며 다른 세포 유형이 섞이지 않도록 보장하는 데 중요합니다. 둘째로, 해리 단계에서는 인내심을 갖고 시간을 들여 뉴런을 분리함으로써 커다란 덩어리로 뭉쳐 있지 않게 해야 합니다. 일단 플레이트에 안착되면, 큰 덩어리들은 작업에 어려움을 줄 수 있습니다.뉴런을 절단하거나 감염시키는 것과 같은 하위 응용 단계에서 면역 염색이 방해받을 수 있으며, 뉴런 수를 세어야 하는 모든 실험 또한 수행하기 어려워질 것입니다. 마지막으로, 배지에 페니실린-스트렙토마이신을 추가로 보충할 필요는 없습니다. 배양액에 페니실린-스트렙토마이신을 추가할 때, 세포를 처음으로 플레이팅할 때만으로도 충분합니다.배지를 교체할 때마다 신선한 uridine five FDU를 배지에 추가하십시오. 저희 연구실에서는 신경 성장 인자 결핍에 반응하는 세포 사멸을 연구하기 위해 교감 신경세포 배양을 이용해 왔습니다. 이것으로 모두 끝났습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

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