Name: 포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: 배우세요 포스트-나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포 전구 세포의 분리 및 배양 방법을. 파파인 소화와 퍼콜 그라데이션 분리를 통해 순수한 뉴런을 얻어 신경발생 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 소중한 제안 바바라 Carletti과 안나 마리 케니 감사합니다. , DK07328 : HYL는 교육 부여 &quot;생화학 및 분자 생물학 호르몬&quot;에 의해 지원됩니다. NIH 교부금 5R01 NS16951 (CAM)에 의해 부분적으로 지원.

1 부 : (동영상에 표시되지 않음) (1-2일 절개 전) 설정 <ol><li> 문화 솔루션과 미디어 준비 : <ul><li> 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Percoll의 dilutions을위한 칼슘, 마그네슘 자유 인산 버퍼 호수 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) : 당 리터, 32g NaCl, 1.2 g KCl, 8g 포도당, 2g 아니 2 PO 4 1g KH 2 PO를 추가 4, 8 ML 2% NaHCO 3 재고, deionized / 증류수 10 ML 1M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0). 1리터 및 7.4에 산도로 볼륨을 조정합니다. 소독 필터. </li><li> HBSS - 포도당 : 칼슘, 마그네슘 무료 행크의 밸런스 소금 솔루션 (HBSS) 및 살균 필터에 추가 포도당 (6g / 리터). 500 ML은 ° C 한달에 최대 4 저장할 수 있습니다. </li><li> 문화 미디어 : 혈청이없는 매체 (SFM)와 10 % FBS 배지. 48 ML하기 Neurobasal - 중간 500 μl 100X GlutaMAX I, 500 μl 100X의 페니실린 - 스트렙토 마이신 (최종 100 단위의 페니실린과 100 μg의 스트렙토 마이신), 6.25 μl 2 M KCl을 (250 μm의 최종) 추가합니다. 9 ML 2 aliquots 40 ML에 가라. 10% FBS 매체를 준비하려면, 9 ML의 나누어지는에 열 inactivated FBS의 1ml를 추가합니다. SFM를 준비하려면 40 ML의 나누어지는에 혈청이없는 보완 B - 27 800 μl를 추가합니다. 소독 필터 2 주 최대 4 ° C에 저장합니다. 각 실험에 대한 새로운 미디어를 만드는 최상의 결과하십시오. </li></ul></li><li> PERCOLL의 DILUTIONS 준비 : <ul><li> Percoll은 액체로 공급되며 그것은 사용하기 전에 산성해야합니다. 산도 7.4에 도달할 때까지 주식을 준비하려면 1-2시간 기간 동안 Percoll 솔루션에 조금씩 1N HCL을 조금 추가합니다. 너무 빨리 HCL를 추가하면 집계에 Percoll의 원인이됩니다. 1N HCL 약 6.5ml은 Percoll의 각 리터 필요합니다. 소독 필터와 4 저장 ° C. </li><li> 35 %, 60 % (권 : 권) Percoll 희석은 Percoll 기울기 단계에서 사용됩니다. Percoll 주식의 35 또는 60 ML을 포함하는 100 ML Percoll의 dilutions 준비, 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 소주의 25 ML은 / 최종 볼륨 H2O deionized. 60 % 용액에 청색 toluidine 몇 방울을 추가, 그것은 인터페이스와 세포를 시각적으로 도움이 될 것입니다. 소독 필터와 4 저장 ° C. </li><li> 부적 절한 버퍼링이 절차를 수행하는 동안 증가 세포 사망의 원인이되므로 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은, 3 개월 이상은 안됩니다. </li></ul></li><li> 준비 COVERSLIPS : 유리 coverslips는 (최고의 카롤 생물 공급 회사의 경우), 가벼운 교반과 함께 실온에서 하룻밤 10% HCL로 씻은 deonized / 증류수로 깨끗이 씻어서 70 % 에탄올에 저장되어 있습니다. 사용하기 전에 단일 coverslips은 불꽃 - 소독 짧게 에탄올 증발까지 오픈 화염 (알콜 램프)를 통해 포셉으로 그들을 개최하여. 12 mm 유리 coverslips는 6 잘 문화 접시에 4 잘 문화 접시와 25 mm coverslips에 삽입할 수 있습니다. </li><li> 기판 코팅 문화 선박 : 그들이 쉽게 현미경으로 시각화를위한 유리 슬라이드에 장착할 수 있으므로 immunofluorescence 얼룩이나 약물 치료의 유리 coverslips에 대한 더 적합합니다. 세포의 큰 숫자는 단백질이나 RNA 샘플을 수집하기 위해 필요한 경우, 세포가 플라스틱 문화를 해부하기 전에 dishes.The 밤에 교양 수있는, 문화에 대한 유리 coverslips 또는 플라스틱 요리는 폴리 - D - 라이신 (500 μg / ML로 코팅되어야합니다; μl / 잘 6 - 잘 접시 800 또는 350 μl / 음 4 - 잘 접시를 위해). 5 MG / 폴리 - D - 라이신의 ML 주식 솔루션은 -20 ° C 후, 멸균 deonized / 증류수 및 사용하기 전에 멸균 필터링 오른쪽에서 희석에 저장됩니다. 문화 선박이 37 incubated 아르 ° C 숙박 (또는 적어도 도금 전에 2 시간 용)과 도금하기 전에 멸균 deonized / 증류수 오른쪽과 함께 두 번 세탁. </li><li> PREPLATING 요리를 준비 :이 요리는 기판의 낮은 농도에 더 쉽게 준수 glial 오염 물질을 제거하는 문화 전에 격리 소뇌 세포를 미리가 도금에 사용됩니다. 폴리 - D - 라이신 (;이 culturing에 사용되는 농도의 1 / 5 주 100 μg / ML)의 그릇 당 4 ML과 문장이 60 mm 플라스틱 문화 요리. 37 품어 ° C 숙박 (또는 적어도 해부하기 전에 2 시간 용). 오른쪽 절개 전에, 폴리 - D - 라이신 솔루션을 제거하는 살균 물로 두 번 설거지를하고 후드의 건조 수 있습니다. </li><li> 압력솥이나 해부 당일 해부 도구를 소독, 20 분 70 %의 에탄올에있는 도구를 잠그다. 필요한 도구 : Permaset 가위, microdissecting 가위, 넷 더몬트 # 5 해부 포셉. </li></ol> 2 부 : 절개 (절개의 날)을위한 준비 - (동영상 시연) 언급하지 않는 한 다음 절차의 모든 조직 문화 후드에서 수행됩니다. <ol><li> 70 % 에탄올로 해부 영역을 아래로 닦아주십시오. ° C 물 목욕이나 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 37로 미디어를 따뜻하게. </li><li> 새로운 Papain 분리 시스템 키트 (워싱턴)를 시작할 때, 알부민 - ovomucoid 억제제의 솔루션을 준비합니다. 32 ML 추가EBSS (얼의 밸런스드 소금 솔루션, 키트에 제공)의 알부민 - ovomucoid 억제제 혼합물과 다른 구성 요소를 준비하는 동안 내용이 용해 수 있습니다. 처음 사용 Reconstitute, 그때 2-8에서 남아있는 솔루션을 저장 ° C 각 키트에 의해 허용되는 다섯 isolations이 완료될 때까지 사용합니다. 것은 </li><li> 분리 키트 (각 유리병은 출생 후의 5 일 마우스 4-15 cerebella의 분리에 충분합니다) 한 papain의 약병에 EBSS 5 ML을 추가합니다. 5 % CO 2 37 papain 병을 플레이스 ° C 배양기 또는 37 ° papain 완전히 해산 및 솔루션 분명히 나타날 때까지 5~10분위한 C 물 목욕. 해부 동안 상온에서 솔루션을 유지합니다. </li><li> 분리 키트에서 하나의 약병에 DNase EBSS 500 μl를 추가합니다. DNase는 전단 변성에 민감 있기 때문에 병을 감청하여 부드럽게 섞는다. papain (최종 농도가 20 단위 / ML의 papain과 0.005 % DNase입니다)이있는 유리병에이 솔루션을 250 μl를 추가합니다. 5.1 또는 6.1 단계에서 사용하기 위해 나머지 DNase의 약병을 저장합니다. </li></ol> 파트 3 : 해부 및 Meninges 제거 <ol><li> C57BL/6J 마우스의 과립 세포 배양을위한 최적의 연령은 출생 후의 일 4-6 EGL peaks1, 10 과립 세포 progenitors의 수입니다. 것입니다 새끼 한 번에 하나씩 해부하다하고 소뇌 해부 더욱 친숙해질 같은 새끼 당 더 이상 6보다 분 해부 시간을 줄이기 위해 시도합니다. 속도는 본질입니다. Percoll 기울기 단계가 무시하는 경우, 여덟 출생 후의 일 5 마우스 새끼 한 6 자 문화 플레이트 (여섯 25 mm coverslips)에 대한 여섯 4 잘 문화 플레이트 (또는 스물넷 12 충분한 세포를 얻을 수 있습니다 - mm의 coverslips). 대략 수율은 강아지와 도금 밀도 당 4 5x106 세포 cells/cm2 1 ~ 5X105을 범위를 수있다는 것입니다. 15~20% 세포가 Percoll step4 중에 손실되기 때문에, 더 많은 동물이 동일한 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 필요합니다. </li><li> 피펫 살균 팰컨 15 ML 원뿔형 플라스틱 튜브에 60 mm 플라스틱 조직 문화 요리 및 10 ML에 HBSS - 포도당 15 ML. 얼음 입어. </li><li> 후드 이외의 70 % 에탄올로 강아지의 머리를 닦아냅니다. 강아지 목을 벨로 Permaset 가위를 사용합니다. (잘린는 동영상에 표시되지 않습니다.) </li><li> 당신은 명확하게 두개골의 뒷면을 볼 수 있도록 후드에서 더몬트 집게로 머리를 잡아. 구멍의 매그넘에 microdissecting 가위를 삽입하고 눈을 향해 직선 절단하여 두뇌에 액세스할 수 있습니다. 피부 껍질, 집게를 사용하여 두뇌를 노출하기 위해 두개골을 올려요. 더몬트 집게를 사용하여 소뇌 및 주변 midbrain을 꼬집어하고 HBSS - 포도당과 함께 접시에 전송할 수 있습니다. (그것은 소뇌가 여전히 주변 조직에 연결된 경우 소뇌을 조작하고 meninges를 제​​거하는 것이 더 쉽습니다.) </li><li> 해부 현미경, 부드럽게 소뇌에서 meninges 껍질 또한 접시에 소뇌를 앵커로 다른 집게를 사용하는 동안 한 멋진 더몬트 # 5 포셉있는 엽 (叶) 사이. 당신은 소뇌의 표면에 혈관을 통지합니다. 이러한 혈관은 meninges을 식별하는 좋은 방법입니다. 소뇌가 헝클어진 흰 ​​모양에 소요 때까지 meninges를 제​​거합니다. midbrain의 나머지 부분에서 소뇌를 구분한다. 는 복부쪽으로 그것을 켜고 복부 소뇌와 인접한 midbrain 사이에 붉은 리본처럼 보이는 맥락막 얼기를 제거합니다. 빨리 해부로 얼음에 15 ML 원뿔 관에 HBSS - 포도당 추운 각 소뇌를 배치합니다. 3 머리를 해부 후 HBSS - 포도당 신선한에 해부 솔루션을 변경합니다. </li></ol> 4 부 : 세포 현탁액 <ol><li> 일단 모든 해부 작업이 완료, 튜브의 HBSS - 포도당을 제거하고 단계 2.4 만든 papain 솔루션으로 대체합니다. 키트 작은 조각의 조직을 절단하는 것이 좋습니다 있지만, 우리는이 나이에 cerebella를 잘라내거나 말하다 필요가 없습니다 것을 발견했습니다. 37 조직 + papain 솔루션 (15 ML 원뿔 튜브) 장소 ° C 물 목욕이나 5% CO 2 37 15~20분에 대한 ° C 배양기. 4-8 cerebella, 37에서 15 분 동안 ° C가 충분합니다; cerebella의 큰 숫자에 대해 20 ~ 30 분 더 있습니다. 부드럽게 관에게 매 3 4 분 선동. </li><li> FBS로 코팅되어 살균 P1000 에어로졸의 피펫 팁로 혼합물을 씹다. 모든 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해이 단계를 부드럽게 마십시오. 소방 광택 유리 pipettes를 사용하지만, 우리는 혈청 살균 코팅 P1000 에어로졸 도움말 단지뿐만 아니라 작동하는지 찾을 수 있습니다. 코트 FBS와 피펫 팁하려면, 피펫 FBS 위아래 두 번 그냥 사용하기 전에. 피펫와 약 10 아래로 움직임이 조직을 떼어 놓다 충분히 있습니다. 이 솔루션은 뿌연 될 것입니다. 정지가 undissociated 조직의 큰 조각은 튜브의 바닥에 해결할 수 있도록 30-60초 위해 앉아 수 있습니다. </li><li> 정지 세포 (주의 B에서 undissociated 조직 조각을 제거하지 제거혈청 코팅 피펫 팁을 가진 신선한 15 ML 원뿔 관에 ottom). 상온에서 5 분 정도 200xg에서 원심 분리기. 다시 서스펜션 매체를 준비합니다. 이렇게하려면, 멸균 튜브에 재구성 알부민 - ovomucoid 억제제 솔루션 300 μl와 2.7 ML EBSS를 섞는다. 2.4 단계에서 DNase 솔루션 150 μl를 추가합니다. </li><li> centrifuging 후, 표면에 뜨는를 버리고 즉시 희석 DNase / 혈청 코팅 P1000 에어로졸 피펫 팁과 단계 4.3에서 준비 알부민 억제제 솔루션 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 다음과 같이 불연속 밀도 기울기를 준비합니다. 15 ML 원뿔 관에 알부민 - ovomucoid 억제제 솔루션의 5 ML을 추가합니다. 위에 조심스럽게 레이어 세포 현탁액. 상온에서 6 분 정도 70xg에서 원심 분리기. 튜브 하단의 Dissociated 세포 펠렛은 멤브레인 조각 인터페이스에 남아 있습니다. </li><li> 이 과립 세포에 농축 아르 문화를 얻는하고자하는 경우, Percoll 기울기 분리 단계 (소뇌 과립 세포의 순수한 문화를 산출하는) 무시하고, 6 부로 진행합니다. 당신이 더 Percoll 기울기 분리에 의해 glia 대형 interneurons에서 과립 세포를 분리하려는 경우 제 5 부로 진행합니다. Percoll 기울기 단계의 사용은 세포의 수율을 줄일 수 있습니다. 우리 손에, 이윤율의 감소는 약 20-35%입니다. 그러나, 약 90% 95-99의 %로 과립 신경 및 전구 세포의 농축 증가가있다. </li></ol> 제 5 부 : Percoll 기울기 분리 <ol><li> 뜨는을 취소하고 즉시 단계 2.4에서 DNase 50 μl와 HBSS - 포도당 2 ML에서 펠렛을 resuspend. 중력에 의한 나일론 메쉬 (기공 크기가 70 μm의) 비록 세포 현탁액을 필터링합니다. 이 단계는 큰 비의 연결 세포를 제거하고 더 나은 단일 세포 현탁액을 위해 제공하는 것입니다. </li><li> 이 화재 - 광택 유리 파스퇴르 pipettes 준비. 이렇게하려면 부드럽게 불꽃은 가장자리가 smoothened 및 피펫 구멍 때까지 유리 피펫의 끝에 원래 크기의 40~50%입니다. 자리가 너무 작게 만들 안됩니다. </li><li> Percoll 기울기를 준비합니다. 50 ML 살균 원뿔 관에 35 % Percoll 솔루션의 장소 10 ML. 60% Percoll (10 ML)은 첨부 살균 척추 바늘로 10 ML 멸균 주사기에로드됩니다. 척추 바늘과 튜브의 하단에있는 60 %의 솔루션을 추가하여 35 % 용액 아래 부드럽게 계층 60 % Percoll 솔루션. 날카로운 인터페이스 두 레이어 사이에 유지하는데주의를 기울여야. 부드럽게 인터페이스를 방해하지 않고 튜브의 측면을 따라 그들을 추가, 불타는 광택 피펫을 사용하여 그라디언트의 상단에 셀을 추가합니다. </li><li> 1800xg에서 원심과 원심의 튜브를 조심스럽게 넣습니다. 그것이 원하는 속도에 도달하는 약 2 분 정도 소요되도록 : 속도가 한 단계마다 20 초 (약 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg 속도의 증가는 다음과 같다)까지 램프. 1800xg에 도달하기 위해 10 분 타이머를 시작합니다. 완료되면, 점차 한 단계마다 20 초 속도 감소. </li><li> 그라디언트의 상위 인터페이스 (대형 glia, Purkinje 세포와 interneurons를 포함)의 제거 및 폐기. </li><li> 신중하게 불을 광택 피펫과 50 ML 원뿔 튜브로 전송으로 35 %, 60 % Percoll 사이의 인터페이스에있는 세포를 제거합니다. HBSS - 포도당과 반전 몇 배 혼합 3 권 Resuspend. 1100xg에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 뜨는를 제거하고 DNase 50 μl와 10% FBS 배지 4 ML를 추가합니다. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 불을 광택 피펫을 사용하여 펠렛을 Resuspend. 6.2 단계로 진행합니다. </li></ol> 6 부 : 사전 도금 및 도금 <ol><li> 뜨는을 취소하고 즉시 단계 2.4에서 DNase 50 μl와 10% FBS 배지 4 ML에서 펠렛을 resuspend. 중력에 의한 나일론 메쉬 (기공 크기가 70 μm의) 비록 세포 현탁액을 필터링합니다. 이 단계는 큰 비의 연결 세포를 제거하고 더 나은 단일 세포 현탁액을 위해 제공하는 것입니다. </li><li> 플레이트 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 20 분 동안 폴리 - D - 라이신 코팅 미리 도금 요리에 수집된 세포. 신선한 요리와 함께 반복합니다. astroglia과 무거운 세포가 진정하고 요리를 준수하고 작은 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포가 떠있는 떠날 것이다. 부화 후, 느슨하게 붙어 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포가 쉽게 dislodged되고 접시의 부드러운 도청과 느슨하게. </li><li> 5 분 200xg에서 15 ML 원뿔 관과 원심 분리기의 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포를 수집합니다. 혈청이없는 배지 1 ML에서 펠렛을 Resuspend과 hemocytometer를 사용하여 10 μl의 나누어지는를 계산합니다. </li><li> 원하는 세포 밀도에 도달하는 혈청이없는 매체를 추가합니다. 중간 밀도에 대한 판에 세포의 숫자가 대략적인 지침 : 6 - 그럼 접시, 3.5-4000000 전지, 4 자 번호판, 650,000 전지. 6 - 잘 문화 접시 들면, 플레이트 1.5 ML / 음과 4 잘 괞찮아드디어, 내가 플레이트 0.5 ML / 음. 세포는 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 유지됩니다. 후속 변경 사항을 모든 2-3일 24 시간 후에 완전히 매체를 변경합니다. </li></ol>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+the+cerebellar+system%3A+in+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+functions%22">Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).</li>
<li>Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHatten%2C+ME+%22in+Culturing+Nerve+Cells%22">in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Mass. 419-419 (1998).</li>
<li>Hatten, M. E. The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).</li>
<li>Carletti, B., Rossi, F. Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).</li>
<li>Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).</li>
<li>Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).</li>
<li>Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).</li>
<li>Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).</li>
<li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalay%2C+SL+%22Cerebellar+Cortex%3A+Cytology+and+Organization%22">Cerebellar Cortex: Cytology and Organization</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1974).</li>
<li>Messer, A. Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).</li>
<li>Ruiz I Altaba, A. Development. 126, 3205-3205 (1999).</li>
<li>Wallace, V. A. Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li>
<li>Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).</li>
<li>Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).</li>
<li>Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).</li>
<li>Kenney, A. M., Rowitch, D. H. Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).</li>
<li>Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. Development. 130 (1), 15-15 (2003).</li>
<li>Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).</li>
</ol>

이 프로토콜은 과거 3,7,11에서 설명했습니다 절차의 변경에 따라 달라집니다. 아래의 논의로 참고하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 과립 신경 및 전구 세포는 도금 2 시간 이내에 준수. 건강한 세포의 위상 대비 현미경 4 아래 둥근 형태 있습니다. 도금 후 24 시간 이내에, 건강한 세포는 coverslips 또는 플라스틱 잘 주위에 균일하게 확산하고, 프로세스를 형성합니다. 최초의 매체 변화의 시간에 24 시간 후, 몇 죽은 세포 부동있을 것입니다. 몇 세포 분리 과정에서 죽게하거나 건강에 해로운가 될로서 이것은 정상입니다. 48 시간 후 세포가 자신의 프로세스에 varicosities 함께 clumped있다면 그러나, 세포는 건강에 해롭습거나 폴리 - D - 라이신 기판은 독성도. 대부분의 기판과 마찬가지로, 폴리 - D - 라이신의 효능은 많이 의존하고 있으며 각각의 새로운 많은 테스트해야합니다. 건강한 문화의 이미지를 참조 4,11, 20에서 찾을 수 있습니다. 건강한 ...

<table><tbody><tr><td>70&amp;mu;m 메쉬 기공 셀 스트레이너</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>척수 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 inches</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 분자량&amp;gt;300,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>Poly-D-Lysine의 각 새 배치는 반드시 테스트해야 함.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>칼슘 및 마그네슘이 포함되지 않아야 함.</td></tr><tr><td>Neurobasal A-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B-27 무혈청 보충제 (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>12-mm 원형 커버슬립</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>독일 Deckgluder 제품임.</td></tr><tr><td>25-mm 원형 커버슬립</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>독일 Deckgluder 제품임.</td></tr><tr><td>Papain 분리 시스템</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>키트 하나당 5회 분리에 적합함.</td></tr><tr><td>Permaset 가위</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>4-웰 배양 접시</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 배양 접시</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

소뇌 피질의 연결 속성과 개발 1,2를 공부에 대해 고유한 기회를 제공하는 잘 설명하는 구조입니다. 소뇌의 연결 유형 (과립 세포, Purkinje 세포와 억제 interneurons)의 과립 뉴런은 지금까지 가장 많은 있으며, 포유류의 두뇌에 신경 가장 풍부한 타입입니다. 설치류 동물에서 소뇌 과립 신경이 소뇌 피질, 외부 과립 층 (EGL)의 바깥쪽 레이어의 전구 세포에서 처음 두 포스트 나탈 주 동안 생성됩니다. 여기에 제시 프로토콜은 풍부 기술과 문화 과립 신경 및 사후 나탈 마우스 소뇌에서 자신의 전구 세포를 설명합니다. 우리는 과립 신경 5,6에 전구 세포를 proliferating의 차별을 연구하는 데 사용할 수있는 순수 증가 3,4의 문화를 구하는 절차를 설명합니다. 일단 전구 세포는 문화가 또한 synaptogenesis, 글루 탐 산염 수용체 기능 7, 기타 정화 소뇌 세포 8,9 또는 세포 사망 7 상호 작용과 같은 현상의 실험적 조작 및 특성에 대한 과립 뉴런의 동질적인 인구를 제공, 차별.

여기서 우리는 분리 방법 및 출생 후의 마우스 문화 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포와 소뇌 과립 신경을 제시.

소뇌 피질은 뉴런의 특성과 발달을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공하는 잘 알려진 구조입니다1,2. ...의

본 절차는 P4에서 P5 단계의 소뇌를 적출하는 것으로 시작합니다. 개별 소뇌에서 신생아 생쥐의 뇌막과 맥락총을 제거한 후, 이를 15 milliliter 원심 분리관(conical tube)에 수집합니다. 이후 파파인(papain)을 사용하여 소뇌를 해리시키고, 부드럽게 파이펫팅하여 단일 세포 현탁액으로 만듭니다.이 현탁액은 공극 크기가 70 micron인 나일론 메쉬를 통해 중력 여과합니다. 여과액을 불연속 perca 구배 위에 조심스럽게 층을 이루어 올린 후 원심분리하여 과립세포를 글리아, 뉴런 및 Perkin 유전자 뉴런으로 분리합니다. 구배의 인터페이스에 있는 세포를 수집하여 poly de lycine 코팅 플레이트에 준비합니다.글리아 세포를 추가로 제거하기 위해, 과립 세포를 수집하고 수를 센 다음 poly-D-lysine이 코팅된 유리 커버슬립 또는 플라스틱 배양 플레이트에 원하는 밀도로 도말합니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 병리학과 Lloyd Green 박사 연구실의 이혜영입니다. 오늘은 생후 마우스로부터 소뇌 과립 뉴런을 분리하고 배양하는 절차를 보여드리겠습니다.당사 실험실에서는 과립 신경 전구세포의 증식과 분화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차는 소뇌 과립 세포를 분리하기 위해 해부 영역에 70% ethanol을 사용하는 것으로 시작하며, Papin dissociation system을 이용합니다.새 키트를 시작할 때, albumin OVO equate MOID 억제제 용액을 준비하십시오. 이를 위해 키트에 제공된 Earl's balanced salt solution 또는 EBSS 32 milliliters를 취해 albumin OVO moid 혼합물에 첨가합니다. 다른 구성 성분을 준비하는 동안 내용물이 용해될 수 있도록 그대로 둡니다.다음으로, 해리 키트에 포함된 파파인 바이알 하나에 EBSS 5 mL를 넣습니다. 바이알 하나당 P5 마우스의 소뇌 4~15개를 해리시키기에 충분한 양입니다. 그 다음, 파파인이 완전히 용해되어 용액이 투명해질 때까지 파파인 바이알을 5% CO₂ 37 °C 인큐베이터에 5~10분 동안 둡니다.해부 과정 중에 용액을 상온으로 유지하십시오. 다음으로, 키트에 포함된 1D NAS 바이알에 EBSS 500 µL를 추가합니다. 바이알을 가볍게 두드려 부드럽게 혼합하십시오.DNAS는 전단 변성에 민감하므로, 이 용액 250 µL를 pepane 바이알에 첨가하여 최종 농도가 20 units/mL 및 0.005% DNA가 되도록 하고, 남은 DNA 파일은 이후 단계에서 사용하기 위해 보관하십시오. 도구와 시약이 모두 준비되면, 본 절차를 위해 소뇌를 해부하고 뇌수막을 제거하는 과정을 진행합니다. 생후 4~6일 된 C57BL/6 마우스를 사용합니다.이 연령대는 외과립층(EGL) 과립세포 전구세포의 수가 최대치에 도달하므로 과립세포 배양에 최적입니다. 먼저 60mm 플라스틱 조직 배양 접시에 HBSS glucose 15mL를, 멸균된 15mL 원추형 튜브에 10mL를 넣습니다. 튜브를 얼음에 두고, 새끼 쥐의 머리를 70% ethanol로 닦아냅니다. 정밀 가위를 사용하여 머리를 제거합니다.머리를 후드 안으로 옮기고, 두개골 뒷면이 명확하게 보이도록 핀셋으로 고정합니다. 뇌에 접근할 수 있도록 미세 해부 가위를 대후두공에 삽입한 후, 눈 방향으로 직선으로 절개합니다. 정밀한 dumont 핀셋을 사용하십시오.다섯 번째로, 포셉을 사용하여 피부를 벗겨내고 두개골을 들어 올려 뇌를 노출시킵니다. 그런 다음 소뇌와 주변의 중뇌를 집어 떼어냅니다. 이를 HBSS glucose가 담긴 디쉬로 옮깁니다.소뇌가 주변 조직에 여전히 부착되어 있을 때 소뇌를 조작하고 수막을 제거하기가 더 쉽다는 점에 유의하십시오. 다음으로, 조직을 해부 현미경 아래에 놓습니다. 그런 다음 포셉 한 쌍을 사용하여 소뇌를 플레이트에 고정합니다.5번 Dumont 미세 핀셋을 사용하여 소뇌 표면과 소엽 사이의 수막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 소뇌 표면에 혈관들이 보일 것입니다.이 혈관들은 뇌수막을 식별하는 좋은 방법입니다. 소뇌가 엉킨 흰색 외관을 띨 때까지 계속해서 뇌수막을 제거하십시오. 그 다음 소뇌를 나머지 중뇌와 분리하십시오.복측으로 뒤집은 후, 복측 소뇌와 인접한 중뇌 사이에 붉은 리본 모양으로 보이는 맥락총을 제거합니다. 소뇌를 적출하는 즉시 얼음 위에 놓인 15 milliliter conical tube 내의 차가운 HBSS glucose에 넣습니다. 뇌 3개를 적출한 후, 적출 용액을 신선한 HBSS glucose로 교체합니다.소뇌 해부에 익숙해지면, 새끼 쥐 한 마리당 해부 시간을 6분 이내로 단축하도록 노력하십시오. 해부가 완료되면 세포 현탁액 제조를 진행합니다. 소뇌 해부 조직으로부터 세포 현탁액을 생성하는 단계로 이동하십시오.먼저 튜브에서 glucose가 포함된 HBSS를 제거하고 papain 용액으로 교체합니다. 키트에서는 조직을 작은 조각으로 자를 것을 권장하지만, 이 연령대의 조직에서는 그럴 필요가 없음을 확인하였습니다. 조직과 papain 용액을 5% CO₂ 37°C 인큐베이터에 15~20분 동안 둡니다.소뇌 4~8개인 경우 15분 동안 배양하십시오. 그보다 많은 수의 소뇌인 경우 최대 30분까지 배양하십시오. 3~4분마다 튜브를 부드럽게 흔들어 섞어주십시오.배양이 완료되면, FBS를 멸균된 P 1000 에어로졸 피펫 팁에 두 번 흡입 및 배출하여 팁을 코팅하는 단계로 시작하십시오. 이제 혼합물을 분주하십시오. 이때 공기 방울이 형성되지 않도록 부드럽게 피펫팅하십시오.피펫으로 10회 정도 위아래로 섞어주면 조직이 충분히 해리됩니다. 이때 용액은 뿌옇게 변해야 합니다. 해리되지 않은 큰 조직 조각들이 튜브 바닥으로 가라앉을 수 있도록 현탁액을 30에서 60초 동안 그대로 둡니다.화염 연마된 유리 피펫을 분주에 사용할 수 있지만, 혈청으로 코팅된 멸균 P 1000 팁도 동일하게 효과적임을 확인하였습니다. 다음으로, 혈청 코팅 피펫 팁을 사용하여 부유 세포를 새로운 15 mL 원추형 튜브로 옮기되, 바닥에 있는 결합되지 않은 조직 조각들이 함께 제거되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 세포 현탁액을 약 200 G에서 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 동안 실온에서 resus 현탁액 매질을 준비합니다. 이를 위해 멸균 튜브에 EBSS 2.7 milliliters를 넣습니다. 그런 다음 재구성된 albumin OVO MOID 억제제 용액 300 microliters를 추가합니다.마지막으로, DNA 용액 150 µL를 추가합니다. 원심분리가 완료되면 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 희석된 DNA 알부민 억제제 용액에 즉시 재현탁합니다. 이때 펠릿을 재현탁하기 위해 다시 혈청 코팅된 피펫 팁을 사용하십시오.이제 불연속 밀도 구배를 준비합니다. 이를 위해, 15 mL 원뿔형 튜브에 albumin oval MOID 억제제 용액 5 mL를 넣습니다. 세포 현탁액을 튜브 벽면을 따라 조심스럽게 첨가하여 용액 위에 층을 형성한 후, 약 70 G에서 6분 동안 원심분리합니다.실온에서 해리된 세포들은 튜브 바닥에 펠렛으로 가라앉고, 막 파편들은 계면에 남게 됩니다. 과립 세포가 풍부한 배양물을 얻고자 한다면 추가적인 정제 과정은 필요하지 않습니다. 상층액을 버리고 펠렛을 DNAs 50 µL가 포함된 10% FBS 배지 4 mL에 즉시 재현탁하십시오.이 현탁액을 공극 크기가 70 microns인 나일론 메시를 통해 중력 여과하십시오. 이 단계는 크기가 큰 비신경세포를 제거하여 더 우수한 단일 세포 현탁액을 만들어 줍니다. 그 다음, 이후의 Percoll 밀도 구배 분리 단계를 건너뛰고 세포 플레이팅 단계로 진행하십시오.또는 glia 및 대형 중간 뉴런으로부터 과립 세포를 추가로 정제하려는 경우, per call gradient 단계로 진행하십시오. 상층액은 버리고 펠렛을 50 µL의 DNAs가 포함된 2 mL의 HBSS glucose에 즉시 재현탁하십시오.다시 한번 나일론 메쉬로 현탁액을 여과합니다. Percoll 밀도 구배 분리를 시작하기 전, 화염 연마된 파스퇴르 피펫 두 개를 준비하십시오. 피펫 끝부분의 가장자리가 매끄러워지고 피펫 내경이 원래 크기의 약 절반이 될 때까지 조심스럽게 가열합니다. 이때 개구부가 너무 작아지지 않도록 주의하십시오.이제 per call 구배액을 만듭니다. 35% per call 용액 10 mils를 50 mil 멸균 원추형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 60% per call 10 mils를 멸균 척수 바늘이 장착된 10 mil 멸균 주사기에 충전합니다.시린지 팁이 튜브 바닥에 닿게 하여 60%per call 용액을 35%용액 아래에 조심스럽게 층을 이뤄 넣어줍니다. 이때 두 층 사이에 명확한 경계면이 유지되도록 주의하십시오. 그다음, 농도 구배의 최상단에 세포를 첨가합니다.화염 연마된 피펫을 사용하여, 계면을 흐트러뜨리지 않도록 튜브의 벽면을 따라 세포를 조심스럽게 첨가합니다. 세포를 층층이 쌓은 후 튜브를 원심분리기에 조심스럽게 넣습니다. 약 18 G의 속도로 원심분리를 시작합니다. 20초마다 한 단계씩 속도를 올려 약 2분 후에 1800 G에 도달하도록 합니다. 1800 G에서 10분간 원심분리한 후, 20초마다 한 단계씩 점진적으로 속도를 줄입니다.원심 분리가 완료되면, 기울기 층의 상부 인터페이스를 제거하여 폐기하십시오. 이 인터페이스에는 크기가 큰 ggl bikini 세포와 인터 뉴런이 포함되어 있습니다. 다음으로, 화염 연마된 피펫을 사용하여 인터페이스에 있는 세포를 조심스럽게 제거하십시오.세포를 50 mL 튜브로 옮깁니다. 부피가 15 mL보다 큰 경우, 두 개의 50 mL 튜브로 나누어 담고 3배 부피의 HB S'S glucose에 재현탁한 후 여러 번 뒤집어 섞습니다. 그런 다음 1100 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 이제 상층액을 제거하고 10% FBS와 50 µL의 D ns reus가 포함된 배지 4 mL를 첨가합니다.화염 연마된 피펫을 사용하여 펠릿을 부드럽게 현탁시켜 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포가 재현탁되면 전착(prepl) 단계를 진행합니다. 수집된 세포를 poly-D-lysine 코팅된 디시에 20분 동안 전착시킵니다.37°C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양합니다. 배양 과정 동안 astroglia와 더 무거운 세포들은 가라앉아 디시에 부착되는 반면, 작은 granule neuron과 neuron progenitor cell은 부유 상태로 남아있거나 느슨하게 부착됩니다. 20분 후, 디시를 가볍게 쳐서 느슨하게 부착된 granule cell을 떼어냅니다.그런 다음 세포 현탁액을 새로운 poly-D-lysine 코팅 플레이트로 옮기고 배양을 반복합니다. 다음으로, 과립 뉴런과 뉴런 전구세포를 15 mL 원추형 튜브에 수집하고 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 이후 펠릿을 1 mL의 C-free 배지로 재현탁하고 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.마지막으로, 중간 밀도로 플레이팅하기 위해 원하는 세포 밀도가 되도록 무혈청 배지를 추가합니다. 6-웰 플레이트의 경우, 4-웰 플레이트당 약 350만에서 400만 개의 세포를 사용하십시오.650,000개의 세포를 사용하십시오. 세포를 5%CO2가 포함된 37°C 인큐베이터에서 배양하십시오. 최초 플레이팅 24시간 후에 배지를 완전히 교체하고, 그 이후로는 2~3일마다 교체하십시오.여기 건강한 과립 세포 뉴런 및 전구 세포 배양의 이미지들이 있습니다. 플레이팅 24시간 후와 플레이팅 6일 후의 모습입니다. 이 세포들은 최대 2주까지 배양 상태로 유지될 수 있습니다.분주 후 24시간 이내에 건강한 세포는 커버슬립이나 플라스틱 웰 주변으로 고르게 퍼지며 돌기를 형성한다는 점에 유의하십시오. 세포 응집이나 세포 돌기에 정맥류(varicosities)가 나타나는 것은 세포 상태가 좋지 않거나 poly-L-lysine 기질이 독성을 띠고 있음을 나타냅니다. 도식에서 볼 수 있듯이, 과립세포 전구세포는 분주 후 분화를 시작하며 마커를 발현합니다.분화 과정의 대표적인 모습입니다. 배지에 sonic hedgehog를 첨가하면 과립 뉴런 전구세포의 증식을 상당히 연장할 수 있습니다. 또한, 신경돌기 성장을 촉진하기 위해 폴리라이신 외에 라미닌을 기질로 추가할 수 있습니다.이러한 과립세포 배양의 특징은 과립 뉴런의 생물학적 특성이나 전구세포의 뉴런 분화 조절을 연구할 수 있는 시스템을 제공합니다. 지금까지 MAO 소뇌 과립 신경 전구세포 및 뉴런을 분리하고 배양하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 대략적인 수율은 4~5 × 10⁶이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.새끼 쥐 한 마리당 6개의 세포를 얻을 수 있으며, 도말 밀도는 cm²당 5개의 세포의 1배에서 5배 사이로 조절할 수 있습니다. 따라서 Percoll 구배 단계(perico gradient step)를 생략할 경우, 생후 5일 된 생쥐 새끼 8마리로부터 4-well 배양 플레이트 6개에 충분한 양의 세포를 확보할 수 있습니다. 본 연구자의 경험으로는 Percoll 구배 단계를 사용하면 세포 수율이 약 22~30% 감소합니다. 하지만 배양물 내 과립 세포(granule neurons)의 비율은 90%에서 95%, 그리고 99%까지 증가합니다. Percoll 구배 분리 단계 없이 얻은 고순도의 과립 세포는 과립 신경 세포 전구체의 증식 및 분화 조절 연구에 사용되어 왔습니다. 그러나 배양물을 체외(in vitro)에서 수일 이상 사용할 경우에는 증식하는 비신경 세포에 의한 과립 신경 세포의 오염을 줄이기 위해 Percoll 구배 단계를 포함하는 것을 권장합니다.또한, per cot 기울기 제작에 사용되는 용액이 신선한지 확인하십시오. 부적절한 완충 작용은 더 많은 세포 사멸을 초래할 수 있기 때문입니다. 여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 1차 마우스 소뇌 과립 뉴런을 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 세포는 증식하는 신경교세포를 제거하고 소뇌 과립 뉴런의 순수한 배양을 생성하기 위해 항대사 산물로 처리됩니다.

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons(마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 분리 및 배양)

이 비디오는 쥐 새끼의 소뇌에서 소뇌 신경 전구 세포의 격리와 배양을 보여줍니다. 소뇌 과립 뉴런 전구세포는 차등 접착을 통해 분리 및 정제되어 성상세포를 효과적으로 제거합니다. 이러한 배양된 전구세포는 이후에 소뇌 과립 뉴런으로 분화합니다.

Isolating and culturing murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors(쥐 소뇌 과립 뉴런 전구 세포)

이 동영상은 출생 후 쥐 소뇌에서 줄기세포를 분리하여 신경세포로 분화하는 방법을 보여줍니다. 분리된 세포 현탁액의 줄기세포는 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 정제되고 배양되어 신경구를 형성합니다. 그런 다음 신경구는 신경 세포를 생성하기 위해 분화 매질에서 유지됩니다.

출생 후 마우스 소뇌에서 줄기세포의 분리 및 신경 세포로의 분화

이 비디오는 마우스의 일차 소뇌 과립 뉴런에서 뉴런 손상 모델의 생성을 보여줍니다. 흥분성 신경전달물질 수용체 작용제인 NMDA와 공동 작용제인 글리신을 사용하여 신경 손상을 유도하는 데 필요한 단계를 설명합니다. NMDA와 글리신은 특정 신경 수용체에 결합하여 과도한 자극을 유발하고 세포 내 칼슘을 대량으로 유입시켜 신경 세포 손상과 사멸을 초래합니다.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons(마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 뉴런 손상 모델링)

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

네 스틴 발현 전구 세포는 개발 소뇌의 신경 전구 세포의 새로 확인 된 집단이다. 형광 - 활성화 세포 분류와 조합하여 여기에 제시된 미세 절제 기술을 사용하여,이 세포 집단은 다른 소뇌 영역에서 오염없이 정제 될 수 있고, 추가 연구 동안 배양 될 수있다.

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

이 연구는 WT 신생아 마우스에서 뉴런을 분리하는 기술을 제시합니다. 신생아 마우스에서 척수를주의 깊게 절개 한 다음 기계적 및 효소 적 절단을 통해 척수 조직에서 뉴런을 분리해야합니다.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

여기에서 입증된 것은 산후 마우스 소뇌로부터 백물 줄기 세포를 정화, 배양 및 분화하는 효율적이고 비용 효율적인 방법입니다.

출생 후 마우스 소뇌에서 프로미닌-1+ 줄기 세포의 정화

배우세요 포스트-나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포 전구 세포의 분리 및 배양 방법을. 파파인 소화와 퍼콜 그라데이션 분리를 통해 순수한 뉴런을 얻어 신경발생 연구에 활용할 수 있습니다.

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

더 많은 동영상 탐색