포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

본 절차는 P4에서 P5 단계의 소뇌를 적출하는 것으로 시작합니다. 개별 소뇌에서 신생아 생쥐의 뇌막과 맥락총을 제거한 후, 이를 15 milliliter 원심 분리관(conical tube)에 수집합니다. 이후 파파인(papain)을 사용하여 소뇌를 해리시키고, 부드럽게 파이펫팅하여 단일 세포 현탁액으로 만듭니다.

이 현탁액은 공극 크기가 70 micron인 나일론 메쉬를 통해 중력 여과합니다. 여과액을 불연속 perca 구배 위에 조심스럽게 층을 이루어 올린 후 원심분리하여 과립세포를 글리아, 뉴런 및 Perkin 유전자 뉴런으로 분리합니다. 구배의 인터페이스에 있는 세포를 수집하여 poly de lycine 코팅 플레이트에 준비합니다.

글리아 세포를 추가로 제거하기 위해, 과립 세포를 수집하고 수를 센 다음 poly-D-lysine이 코팅된 유리 커버슬립 또는 플라스틱 배양 플레이트에 원하는 밀도로 도말합니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 병리학과 Lloyd Green 박사 연구실의 이혜영입니다. 오늘은 생후 마우스로부터 소뇌 과립 뉴런을 분리하고 배양하는 절차를 보여드리겠습니다.

당사 실험실에서는 과립 신경 전구세포의 증식과 분화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차는 소뇌 과립 세포를 분리하기 위해 해부 영역에 70% ethanol을 사용하는 것으로 시작하며, Papin dissociation system을 이용합니다.

새 키트를 시작할 때, albumin OVO equate MOID 억제제 용액을 준비하십시오. 이를 위해 키트에 제공된 Earl's balanced salt solution 또는 EBSS 32 milliliters를 취해 albumin OVO moid 혼합물에 첨가합니다. 다른 구성 성분을 준비하는 동안 내용물이 용해될 수 있도록 그대로 둡니다.

다음으로, 해리 키트에 포함된 파파인 바이알 하나에 EBSS 5 mL를 넣습니다. 바이알 하나당 P5 마우스의 소뇌 4~15개를 해리시키기에 충분한 양입니다. 그 다음, 파파인이 완전히 용해되어 용액이 투명해질 때까지 파파인 바이알을 5% CO₂ 37 °C 인큐베이터에 5~10분 동안 둡니다.

해부 과정 중에 용액을 상온으로 유지하십시오. 다음으로, 키트에 포함된 1D NAS 바이알에 EBSS 500 µL를 추가합니다. 바이알을 가볍게 두드려 부드럽게 혼합하십시오.

DNAS는 전단 변성에 민감하므로, 이 용액 250 µL를 pepane 바이알에 첨가하여 최종 농도가 20 units/mL 및 0.005% DNA가 되도록 하고, 남은 DNA 파일은 이후 단계에서 사용하기 위해 보관하십시오. 도구와 시약이 모두 준비되면, 본 절차를 위해 소뇌를 해부하고 뇌수막을 제거하는 과정을 진행합니다. 생후 4~6일 된 C57BL/6 마우스를 사용합니다.

이 연령대는 외과립층(EGL) 과립세포 전구세포의 수가 최대치에 도달하므로 과립세포 배양에 최적입니다. 먼저 60mm 플라스틱 조직 배양 접시에 HBSS glucose 15mL를, 멸균된 15mL 원추형 튜브에 10mL를 넣습니다. 튜브를 얼음에 두고, 새끼 쥐의 머리를 70% ethanol로 닦아냅니다. 정밀 가위를 사용하여 머리를 제거합니다.

머리를 후드 안으로 옮기고, 두개골 뒷면이 명확하게 보이도록 핀셋으로 고정합니다. 뇌에 접근할 수 있도록 미세 해부 가위를 대후두공에 삽입한 후, 눈 방향으로 직선으로 절개합니다. 정밀한 dumont 핀셋을 사용하십시오.

다섯 번째로, 포셉을 사용하여 피부를 벗겨내고 두개골을 들어 올려 뇌를 노출시킵니다. 그런 다음 소뇌와 주변의 중뇌를 집어 떼어냅니다. 이를 HBSS glucose가 담긴 디쉬로 옮깁니다.

소뇌가 주변 조직에 여전히 부착되어 있을 때 소뇌를 조작하고 수막을 제거하기가 더 쉽다는 점에 유의하십시오. 다음으로, 조직을 해부 현미경 아래에 놓습니다. 그런 다음 포셉 한 쌍을 사용하여 소뇌를 플레이트에 고정합니다.

5번 Dumont 미세 핀셋을 사용하여 소뇌 표면과 소엽 사이의 수막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 소뇌 표면에 혈관들이 보일 것입니다.

이 혈관들은 뇌수막을 식별하는 좋은 방법입니다. 소뇌가 엉킨 흰색 외관을 띨 때까지 계속해서 뇌수막을 제거하십시오. 그 다음 소뇌를 나머지 중뇌와 분리하십시오.

복측으로 뒤집은 후, 복측 소뇌와 인접한 중뇌 사이에 붉은 리본 모양으로 보이는 맥락총을 제거합니다. 소뇌를 적출하는 즉시 얼음 위에 놓인 15 milliliter conical tube 내의 차가운 HBSS glucose에 넣습니다. 뇌 3개를 적출한 후, 적출 용액을 신선한 HBSS glucose로 교체합니다.

소뇌 해부에 익숙해지면, 새끼 쥐 한 마리당 해부 시간을 6분 이내로 단축하도록 노력하십시오. 해부가 완료되면 세포 현탁액 제조를 진행합니다. 소뇌 해부 조직으로부터 세포 현탁액을 생성하는 단계로 이동하십시오.

먼저 튜브에서 glucose가 포함된 HBSS를 제거하고 papain 용액으로 교체합니다. 키트에서는 조직을 작은 조각으로 자를 것을 권장하지만, 이 연령대의 조직에서는 그럴 필요가 없음을 확인하였습니다. 조직과 papain 용액을 5% CO₂ 37°C 인큐베이터에 15~20분 동안 둡니다.

소뇌 4~8개인 경우 15분 동안 배양하십시오. 그보다 많은 수의 소뇌인 경우 최대 30분까지 배양하십시오. 3~4분마다 튜브를 부드럽게 흔들어 섞어주십시오.

배양이 완료되면, FBS를 멸균된 P 1000 에어로졸 피펫 팁에 두 번 흡입 및 배출하여 팁을 코팅하는 단계로 시작하십시오. 이제 혼합물을 분주하십시오. 이때 공기 방울이 형성되지 않도록 부드럽게 피펫팅하십시오.

피펫으로 10회 정도 위아래로 섞어주면 조직이 충분히 해리됩니다. 이때 용액은 뿌옇게 변해야 합니다. 해리되지 않은 큰 조직 조각들이 튜브 바닥으로 가라앉을 수 있도록 현탁액을 30에서 60초 동안 그대로 둡니다.

화염 연마된 유리 피펫을 분주에 사용할 수 있지만, 혈청으로 코팅된 멸균 P 1000 팁도 동일하게 효과적임을 확인하였습니다. 다음으로, 혈청 코팅 피펫 팁을 사용하여 부유 세포를 새로운 15 mL 원추형 튜브로 옮기되, 바닥에 있는 결합되지 않은 조직 조각들이 함께 제거되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 세포 현탁액을 약 200 G에서 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 동안 실온에서 resus 현탁액 매질을 준비합니다. 이를 위해 멸균 튜브에 EBSS 2.7 milliliters를 넣습니다. 그런 다음 재구성된 albumin OVO MOID 억제제 용액 300 microliters를 추가합니다.

마지막으로, DNA 용액 150 µL를 추가합니다. 원심분리가 완료되면 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 희석된 DNA 알부민 억제제 용액에 즉시 재현탁합니다. 이때 펠릿을 재현탁하기 위해 다시 혈청 코팅된 피펫 팁을 사용하십시오.

이제 불연속 밀도 구배를 준비합니다. 이를 위해, 15 mL 원뿔형 튜브에 albumin oval MOID 억제제 용액 5 mL를 넣습니다. 세포 현탁액을 튜브 벽면을 따라 조심스럽게 첨가하여 용액 위에 층을 형성한 후, 약 70 G에서 6분 동안 원심분리합니다.

실온에서 해리된 세포들은 튜브 바닥에 펠렛으로 가라앉고, 막 파편들은 계면에 남게 됩니다. 과립 세포가 풍부한 배양물을 얻고자 한다면 추가적인 정제 과정은 필요하지 않습니다. 상층액을 버리고 펠렛을 DNAs 50 µL가 포함된 10% FBS 배지 4 mL에 즉시 재현탁하십시오.

이 현탁액을 공극 크기가 70 microns인 나일론 메시를 통해 중력 여과하십시오. 이 단계는 크기가 큰 비신경세포를 제거하여 더 우수한 단일 세포 현탁액을 만들어 줍니다. 그 다음, 이후의 Percoll 밀도 구배 분리 단계를 건너뛰고 세포 플레이팅 단계로 진행하십시오.

또는 glia 및 대형 중간 뉴런으로부터 과립 세포를 추가로 정제하려는 경우, per call gradient 단계로 진행하십시오. 상층액은 버리고 펠렛을 50 µL의 DNAs가 포함된 2 mL의 HBSS glucose에 즉시 재현탁하십시오.

다시 한번 나일론 메쉬로 현탁액을 여과합니다. Percoll 밀도 구배 분리를 시작하기 전, 화염 연마된 파스퇴르 피펫 두 개를 준비하십시오. 피펫 끝부분의 가장자리가 매끄러워지고 피펫 내경이 원래 크기의 약 절반이 될 때까지 조심스럽게 가열합니다. 이때 개구부가 너무 작아지지 않도록 주의하십시오.

이제 per call 구배액을 만듭니다. 35% per call 용액 10 mils를 50 mil 멸균 원추형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 60% per call 10 mils를 멸균 척수 바늘이 장착된 10 mil 멸균 주사기에 충전합니다.

시린지 팁이 튜브 바닥에 닿게 하여 60%per call 용액을 35%용액 아래에 조심스럽게 층을 이뤄 넣어줍니다. 이때 두 층 사이에 명확한 경계면이 유지되도록 주의하십시오. 그다음, 농도 구배의 최상단에 세포를 첨가합니다.

화염 연마된 피펫을 사용하여, 계면을 흐트러뜨리지 않도록 튜브의 벽면을 따라 세포를 조심스럽게 첨가합니다. 세포를 층층이 쌓은 후 튜브를 원심분리기에 조심스럽게 넣습니다. 약 18 G의 속도로 원심분리를 시작합니다. 20초마다 한 단계씩 속도를 올려 약 2분 후에 1800 G에 도달하도록 합니다. 1800 G에서 10분간 원심분리한 후, 20초마다 한 단계씩 점진적으로 속도를 줄입니다.

원심 분리가 완료되면, 기울기 층의 상부 인터페이스를 제거하여 폐기하십시오. 이 인터페이스에는 크기가 큰 ggl bikini 세포와 인터 뉴런이 포함되어 있습니다. 다음으로, 화염 연마된 피펫을 사용하여 인터페이스에 있는 세포를 조심스럽게 제거하십시오.

세포를 50 mL 튜브로 옮깁니다. 부피가 15 mL보다 큰 경우, 두 개의 50 mL 튜브로 나누어 담고 3배 부피의 HB S'S glucose에 재현탁한 후 여러 번 뒤집어 섞습니다. 그런 다음 1100 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 이제 상층액을 제거하고 10% FBS와 50 µL의 D ns reus가 포함된 배지 4 mL를 첨가합니다.

화염 연마된 피펫을 사용하여 펠릿을 부드럽게 현탁시켜 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포가 재현탁되면 전착(prepl) 단계를 진행합니다. 수집된 세포를 poly-D-lysine 코팅된 디시에 20분 동안 전착시킵니다.

37°C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양합니다. 배양 과정 동안 astroglia와 더 무거운 세포들은 가라앉아 디시에 부착되는 반면, 작은 granule neuron과 neuron progenitor cell은 부유 상태로 남아있거나 느슨하게 부착됩니다. 20분 후, 디시를 가볍게 쳐서 느슨하게 부착된 granule cell을 떼어냅니다.

그런 다음 세포 현탁액을 새로운 poly-D-lysine 코팅 플레이트로 옮기고 배양을 반복합니다. 다음으로, 과립 뉴런과 뉴런 전구세포를 15 mL 원추형 튜브에 수집하고 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 이후 펠릿을 1 mL의 C-free 배지로 재현탁하고 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

마지막으로, 중간 밀도로 플레이팅하기 위해 원하는 세포 밀도가 되도록 무혈청 배지를 추가합니다. 6-웰 플레이트의 경우, 4-웰 플레이트당 약 350만에서 400만 개의 세포를 사용하십시오.

650,000개의 세포를 사용하십시오. 세포를 5%CO2가 포함된 37°C 인큐베이터에서 배양하십시오. 최초 플레이팅 24시간 후에 배지를 완전히 교체하고, 그 이후로는 2~3일마다 교체하십시오.

여기 건강한 과립 세포 뉴런 및 전구 세포 배양의 이미지들이 있습니다. 플레이팅 24시간 후와 플레이팅 6일 후의 모습입니다. 이 세포들은 최대 2주까지 배양 상태로 유지될 수 있습니다.

분주 후 24시간 이내에 건강한 세포는 커버슬립이나 플라스틱 웰 주변으로 고르게 퍼지며 돌기를 형성한다는 점에 유의하십시오. 세포 응집이나 세포 돌기에 정맥류(varicosities)가 나타나는 것은 세포 상태가 좋지 않거나 poly-L-lysine 기질이 독성을 띠고 있음을 나타냅니다. 도식에서 볼 수 있듯이, 과립세포 전구세포는 분주 후 분화를 시작하며 마커를 발현합니다.

분화 과정의 대표적인 모습입니다. 배지에 sonic hedgehog를 첨가하면 과립 뉴런 전구세포의 증식을 상당히 연장할 수 있습니다. 또한, 신경돌기 성장을 촉진하기 위해 폴리라이신 외에 라미닌을 기질로 추가할 수 있습니다.

이러한 과립세포 배양의 특징은 과립 뉴런의 생물학적 특성이나 전구세포의 뉴런 분화 조절을 연구할 수 있는 시스템을 제공합니다. 지금까지 MAO 소뇌 과립 신경 전구세포 및 뉴런을 분리하고 배양하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 대략적인 수율은 4~5 × 10⁶이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

새끼 쥐 한 마리당 6개의 세포를 얻을 수 있으며, 도말 밀도는 cm²당 5개의 세포의 1배에서 5배 사이로 조절할 수 있습니다. 따라서 Percoll 구배 단계(perico gradient step)를 생략할 경우, 생후 5일 된 생쥐 새끼 8마리로부터 4-well 배양 플레이트 6개에 충분한 양의 세포를 확보할 수 있습니다. 본 연구자의 경험으로는 Percoll 구배 단계를 사용하면 세포 수율이 약 22~30% 감소합니다. 하지만 배양물 내 과립 세포(granule neurons)의 비율은 90%에서 95%, 그리고 99%까지 증가합니다. Percoll 구배 분리 단계 없이 얻은 고순도의 과립 세포는 과립 신경 세포 전구체의 증식 및 분화 조절 연구에 사용되어 왔습니다. 그러나 배양물을 체외(in vitro)에서 수일 이상 사용할 경우에는 증식하는 비신경 세포에 의한 과립 신경 세포의 오염을 줄이기 위해 Percoll 구배 단계를 포함하는 것을 권장합니다.

또한, per cot 기울기 제작에 사용되는 용액이 신선한지 확인하십시오. 부적절한 완충 작용은 더 많은 세포 사멸을 초래할 수 있기 때문입니다. 여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.