Name: using p1 phage to move antibiotic resistance in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:46.000Z
Duration: 11 min 21 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

1. Opzetten
<ol>
	<li>Voordat u begint met elk werk dat microben betreft, steriliseert u de werkruimte met 70% ethanol. Gebruik altijd de noodzakelijke PPL (labcoat en handschoenen).</li>
	<li>Zorg ervoor dat LB-agarplaten met 1x ampicilline, commercieel verkrijgbare P1-fagelyoseetoplossing, chloroform, 1 M natriumcitraat, glycerol en een doos voorgesteriliseerde plastic pipettenpunten en celverspreiders binnen handbereik zijn.</li>
	<li>Bereid steriel LB voor door autoclavage en gebruik het om drie 1 mL aliquoten van LB-zout oplossing te maken.
	<ol>
		<li>mM MgCl2 (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl2 (11,098 mg), 0,1-0,2% glucose (100-200 μg)</li>
		<li>mM MgSO4 (12,0366 mg), 5 mM CaCl2 (11,098 mg)</li>
		<li>mM natriumcitraat (25,806 mg)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nadat u klaar bent, steriliseert u alle oppervlakken evenals handschoenen met 70% ethanol en wast u uw handen.</li>
</ol>
2. Protocol
<ol>
	<li>Bereiding van donorfagelyoseet
	<ol>
		<li>Bereid een 1 mL cultuur van donor W3110 stam E. coli in LB met 1x ampicilline die overnacht bij 37 °C is gekweekt met beluchting en geschud bij 220 rpm.</li>
		<li>Verdun deze overnacht cultuur 1:100 in 1 mL verse LB aangevuld met 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 en 0,1-0,2% glucose.</li>
		<li>Laat deze bacteriële verdunning groeien bij 37 °C gedurende 2 uur met beluchting en geschud bij 220 rpm.</li>
		<li>Zodra deze cellen de vroege logaritmische groeifase hebben bereikt (merkbare groei en lichte troebelheid), voeg 40 μL commercieel verkrijgbaar P1-fagel toe en laat het bij 37 °C met beluchting en geschud bij 220 rpm staan.
		<ol>
			<li>Voor de fageltoevoeging moet de gemeten optische dichtheid bij 600 nm van deze cellen ongeveer 0,4 zijn (6).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bewaak de cellen gedurende 1-3 uur totdat de cultuur is gelyseerd.
		<ol>
			<li>Lyse zal resulteren in verhoogd cellulair puin en een opvallende afname in troebelheid (d.w.z. cellen worden beschouwd als gelyseerd zodra men door de cultuur kan zien).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Voeg verschillende druppels (50-100 μL) chloroform toe aan het lyseet en meng door te vortexen.
		<ol>
			<li>Chloroform steriliseert het fagelyoseet door alle resterende donorcellen te doden, waardoor alleen fagel en een verhoging van de titer van dit lyseet achterblijven.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Centrifugeer lyseet bij 14.000 rpm gedurende 2 minuten om puin te verwijderen en breng de supernatant over naar een nieuwe buis.</li>
		<li>Voeg een paar druppels chloroform toe en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal één dag.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transductie
	<ol>
		<li>Bereid een 1 mL cultuur van receptor J53 stam E. coli die overnacht is gekweekt in LB bij 37 °C met beluchting en geschud bij 220 rpm.</li>
		<li>Breng 100 μL donorfagelyoseet (2.1) over in een 1,5 mL microfugebuis en incubeer met open dop bij 37 °C gedurende 30 minuten.
		<ol>
			<li>Deze incubatie zorgt ervoor dat eventueel overgebleven chloroform in de P1-lyseeoplossing kan verdampen voordat het aan de receptorcellen wordt toegevoegd.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pellet de cellen van de receptorstam voorzichtig door centrifugatie bij 6.000 rpm gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Resuspendeer deze cellen in 300 μL verse LB bevattende 100 mM MgSO4 en 5 mM CaCl2. (P1-fagel vereist calcium om besmettelijk te zijn).</li>
		<li>Stel twee reacties in met behulp van de receptorbacteriecellen en het bereide donorfagelyoseet: 1) transductiereactie die 100 μL receptor J53 stam E. coli combineert met 100 μL donorfagelyoseet, en 2) negatieve controle die 100 μL receptor J53 stam E. coli combineert met 100 μL LB bevattende 100 mM MgSO4 en 5 mM CaCl2.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten met schudbeweging bij 220 rpm.</li>
		<li>Voeg 1 mL LB en 200 μL 1M natriumcitraat (pH=5,5) toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met schudbeweging bij 220 rpm.
		<ol>
			<li>Citraat wordt gebruikt om de besmettelijkheid van P1 te verminderen door chelatisering met calcium, waardoor de lyse van de receptorbacteriën wordt voorkomen.</li>
			<li>Incubatie van deze oplossing zorgt voor de expressie van het ampicilline-resistentiemarker.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pellet cellen door centrifugatie bij 6.000 rpm gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Resuspendeer de celpellets in 100 μL LB met 100 mM natriumcitraat (pH 5,5). Vortex en plateer de volledige oplossing voor beide reacties op twee LB-agarplaten.
		<ol>
			<li>LB-plaat moet 1x Amp hebben voor het getransduceerde monster en geen Amp voor de negatieve controle.</li>
			<li>P1-fagelcontamina

De overdracht van genen naar en van bacteriën door bacteriofagen, hoewel een natuurlijk proces, is uiterst nuttig gebleken voor een groot aantal onderzoeksdoeleinden. Hoewel andere methoden van genoverdracht zoals transformatie en conjugatie mogelijk zijn, gebruikt transductie uniek bacteriofagen; niet alleen toestaand voor genintegratie in het gastheergenoom, maar ook voor genlevering aan meerdere bacteriën die niet vatbaar zijn voor andere methoden. Dit proces, dat vooral in het laboratorium nuttig is, is ook gebruikt ...

fagen-transductie: een methode om ampicilline-resistentie over te brengen van donor naar ontvanger e. coli

Bron: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1 
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA
Transductie is een vorm van genetische uitwisseling tussen bacteriën die bacteriofagen, of fagen, een klasse van virussen die exclusief prokaryotische organismen infecteren, gebruikt. Deze vorm van DNA-overdracht, van de ene bacterie naar de andere via een faag, werd in 1951 ontdekt door Norton Zinder en Joshua Ledererg, die het proces 'transductie' noemden (1). Bacteriofagen werden voor het eerst ontdekt in 1915 door de Britse bacterioloog Frederick Twort, en vervolgens onafhankelijk ontdekt in 1917 door de Frans-Canadese microbioloog Felix d'Herelle (2). Sindsdien zijn de structuur en functie van deze fagen uitgebreid gekarakteriseerd (3), waarbij deze fagen in twee klassen werden verdeeld. De eerste van deze klassen zijn de lytische fagen die bij infectie zich vermenigvuldigen binnen de gastheerbacterie, de bacteriële metabolisme verstoren, de cel lyseren en dochterfagus vrijgeven (4). Als gevolg van deze antibacteriële activiteit en de toenemende prevalentie van antibioticaresistente bacteriën, zijn deze lytische fagen onlangs nuttig gebleken als alternatief behandeling voor antibiotica. De tweede van deze klassen zijn de lysogene fagen die zich via de lytische cyclus in de gastheer kunnen vermenigvuldigen of een rusttoestand kunnen ingaan waarin hun genoom geïntegreerd is in dat van de gastheer (Figuur 1), een proces dat lysogenie wordt genoemd, met de mogelijkheid dat fagenproductie in meerdere latere generaties wordt geïnduceerd (4).
<img alt="Diagram van de levenscyclus van bacteriofagen, DNA-injectie in gastheercel, virale replicatieproces uitgelegd." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Infectie van gastheercel door bacteriofaag. Adsorptie door de faag aan de bacteriële celwand via interacties tussen de staartvezels en receptor (paars). Eenmaal op het celoppervlak, wordt de faag onomkeerbaar aan de bacteriële cel gehecht met behulp van de basisplaat (zwart) die door de samentrekkende schede (geel) naar de celwand wordt bewogen. Het fagengenoom (rood) komt vervolgens de cel binnen en integreert zich in het genoom van de gastheercel.
Terwijl bacteriële transductie een natuurlijk voorkomend proces is, is het met behulp van moderne technologie gemanipuleerd voor de overdracht van genen naar bacteriën in een laboratoriumomgeving. Door genen van belang in het genoom van een lysogene faag, zoals faag, in te voegen, is het mogelijk om deze genen over te dragen naar de genomen van bacteriën en deze vervolgens in deze cellen tot expressie te brengen. Terwijl andere methoden van genoverdracht, zoals transformatie, een plasmide gebruiken voor genoverdracht en -expressie, heeft de invoeging van het fagengenoom in dat van de ontvangende bacterie niet alleen het potentieel om nieuwe eigenschappen aan deze bacterie te geven, maar maakt het ook mogelijk voor natuurlijk voorkomende mutaties en andere factoren van de cellulaire omgeving om de functie van het overgedragen gen te veranderen.
In vergelijking met andere methoden van horizontale genoverdracht, zoals conjugatie, is transductie redelijk flexibel in de criteria die vereist zijn voor donor- en ontvangende cellen. Elk genetisch element dat binnen het genoom van de gebruikte faag kan passen, kan worden overgedragen van elke stam van donorbacteriën naar elke stam van ontvangende bacteriën, zolang beide permissief zijn voor de faag, waarbij de expressie van de noodzakelijke fagenreceptoren op de celoppervlakken vereist is. Zodra dit gen uit het donorgenoom is verplaatst en in de faag is verpakt, kan het naar de ontvanger worden overgedragen. Na transductie is het noodzakelijk om te selecteren voor ontvangende bacteriën die het gen van belang bevatten, dat moet worden geselecteerd. Dit kan worden gedaan door gebruik te maken van een genetisch marker, zoals een FLAG-tag of polyhistidine-tag, om het gen van belang te markeren, of de intrinsieke functie van het gen, in het geval van genen die coderen voor antibioticaresistentie. Bovendien kan PCR worden gebruikt om succesvolle transductie verder te bevestigen. Door primers te gebruiken voor een regio binnen het gen van belang en het signaal te vergelijken met een positieve controle, bacteriën die het gen van belang hebben, en een negatieve controle, bacteriën die dezelfde stappen ondergingen als de transductiereactie zonder faag. Hoewel bacteriële transductie een nuttig hulpmiddel is in de moleculaire biologie, heeft het een en blijft het een belangrijke rol spelen in de evolutie van bacteriën, met name met betrekking tot de recente toename van antibioticaresistentie.
In dit experiment werd bacteriële transductie gebruikt om het gen dat codeert voor resistentie tegen het antibioticum ampicilline over te dragen van de W3110-stam van E.coli naar de J53-stam via de P1-bacteriofaag (5). Dit experiment bestond uit twee hoofdstappen. Ten eerste, de bereiding van P1-faag met het ampicilline-resistentiegen van de donor-stam. Ten tweede, de overdracht van dit gen naar de ontvangende stam door transductie met de P1-faag (Figuur 1). Eenmaal uitgevoerd, kon de succesvolle overdracht van het ampicilline-resistentiegen worden bepaald door qPCR (Figuur 2). Als transductie succesvol was, zou de J53-stam van E. coli resistent zijn tegen ampicilline, en het gen dat deze resistentie verleent detecteerbaar is door qPCR. Als het niet succesvol was, zou er geen detectie van het ampicilline-resistentiegen zijn en zou ampicilline nog steeds als een effectief antibioticum tegen de J53-stam functioneren.

<img alt="Staafgrafiek van de transductie-efficiëntie uit qPCR-resultaten die getransduceerde versus negatieve controlemonsters tonen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig2.jpg" data-altupdatedat="17618

Fagen-transductie: een methode om ampicilline-resistentie over te brengen van donor naar ontvanger E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Bacteriën kunnen zich snel aanpassen aan een snel veranderende omgeving door genetisch materiaal uit te wisselen en een manier om dit te doen is via transductie, de uitwisseling van genetisch materiaal gemedieerd door bacteriële virussen. Een bacteriofaag, vaak afgekort tot faag, is een type virus dat bacteriën infecteert door zich eerst aan het oppervlak van de gastheer te hechten en vervolgens zijn DNA in de bacteriële cel te injecteren. Vervolgens degradeert het de eigen DNA van de gastheercel en repliceert zijn virale genoom, terwijl het de machinerie van de cel kapt om veel kopieën van zijn eiwitten te synthetiseren. Deze fage-eiwitten verzamelen zichzelf en verpakken de fage-genomen om meerdere nakomelingen te vormen. Echter, vanwege de lage trouw van het DNA-verpakkingsmechanisme, verpakt de faag af en toe fragmenten van bacterieel DNA in de faag-capsiden. Na het induceren van de lysis van de gastheer, worden de faagnakomelingen vrijgelaten en wanneer zo'n faag een andere gastheercel infecteert, brengt hij het DNA-fragment van zijn vorige gastheer over. Dit kan dan recombineren en permanent worden geïncorporeerd in het chromosoom van de nieuwe gastheer, waardoor genoverdracht tussen de twee bacteriën wordt gemedieerd.Om faagtransductie in het laboratorium uit te voeren, is een donorstam nodig die een gen van belang bevat, een ontvangerstam die het niet heeft, een faag die beide stammen kan infecteren en een methode om de getransduceerde bacteriën te selecteren. In de meeste gevallen zal dit een selectief vast groeimedium zijn dat de groei van getransduceerde bacteriën ondersteunt, maar de groei van niet-getransduceerde bacteriën remt. Om te beginnen wordt de donor-stam die het gen van belang bevat gekweekt in een vloeibaar groeimedium. Wanneer alle bacteriën actief delen in de logfase van hun groei, wordt de cultuur geïnoculeerd met de doelfaag. Na drie tot vier uur incubatie, wanneer bijna alle bacteriën zijn gelyseerd en de faagdeeltjes hebben vrijgegeven, wordt het donorfaaglysaat geïnoculeerd in een vers gekweekte cultuur van de ontvanger-bacteriestam. Na een korte incubatie van een uur, zou de cultuur nu een mengsel van getransduceerde en niet-getransduceerde bacteriecellen moeten bevatten en dit wordt gescreend op de getransduceerde cellen door een fractie van de suspensie te verspreiden op een geschikt selectief vast groeimedium. Bij verdere incubatie zouden de getransduceerde cellen moeten groeien en zich vermenigvuldigen om zichtbare kolonies te vormen. Deze kolonies kunnen vervolgens worden geselecteerd voor verdere analyse met behulp van verschillende methoden om een succesvolle transductie verder te bevestigen, zoals kolonie-PCR, DNA-sequencing of kwantitatieve PCR.Voordat u met de procedure begint, draagt u alle geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief een laboratoriumjas en handschoenen. Steriliseer vervolgens de werkruimte met 70% ethanol en veeg het oppervlak schoon.Bereidt vervolgens drie een-milliliter aliquots van LB-zout-oplossing. Bereid nu een donor-stam-cultuur door 100 microliters E. coli toe te voegen aan een 15 milliliter conische flacon met vijf milliliter LB-groeimedium met 500 microgram ampicilline. Laat vervolgens de cultuur overnacht groeien bij 37 graden Celsius met beluchting en schuddend op 220 rpm. De volgende dag veegt u het werkblad schoon met 70% ethanol voordat u de cultuur uit de schuddende incubator verwijdert. Verdun vervolgens de overnachtelijke cultuur een op honderd door 10 microliters donor-stam toe te voegen aan 990 microliters vers LB aangevuld met zout-oplossing.Laat de bacteriële verdunning twee uur groeien bij 37 graden Celsius met beluchting en schuddend op 220 rpm. Zodra de cellen de vroege log-fase hebben bereikt, verwijdert u de cultuur uit de incubator, voegt u 40 microliters P1-faag toe aan de cultuur en incubeert u opnieuw. Blijf de cellen één tot drie uur monitoren totdat de cultuur is gelyseerd. Voeg vervolgens 50 tot 100 microliters chloroform toe aan het lysaat en meng door te vortexen. Centrifugeer vervolgens het lysaat om puin te verwijderen en breng de supernatant over naar een verse buis. Voeg een paar druppels chloroform toe aan de supernatant en bewaar deze niet langer dan één dag bij vier graden Celsius.Om de transductieprocedure te beginnen, verkrijgt u een een-milliliter-cultuur van de ontvanger-stam. Breng vervolgens 100 microliters donor-faaglysaat over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en incubeer deze bij 37 graden Celsius met de dop open gedurende 30 minuten om eventueel aanwezig chloroform te laten verdampen. Terwijl het donor-faaglysaat incubeert, peletteert u de ontvanger-stam-cellen via zachte centrifugatie. Gooi de supernatant weg en resuspendeer het cellenpelletje in 300 microliters vers LB bevattend 100 millimolar magnesiumsulfaat en vijf millimolar calciumchloride.Stel vervolgens de transductiereactie in door 100 microliters van de ontvanger-stam en 100 microliters van het donor-faaglysaat te combineren in een microcentrifugebuis. Stel vervolgens de negatieve controle in door 100 microliters van de ontvanger-stam en 100 microliters LB met magnesiumsulfaat en calciumchloride te combineren. Na incubatie voegt u 200 microliters van een molaire natriumcitraat-oplossing en een milliliter LB toe aan beide buisjes en mengt u door voorzichtig op en neer te pipetteren. Nadat de buisjes een uur zijn geïncubeerd, peletteert u de cellen voorzichtig door centrifugatie.Na centrifugatie gooit u de supernatant weg en resuspendeert u de gepeletteerde cellen in 100 microliters LB met 100 millimolar natriumcitraat. Vortex de oplossingen en pipet de gehele getransduceerde monster op een LB-agarplaat met 1X ampicilline. Pipet tenslotte de volledige inhoud van het negatieve controle-cellenmengsel op een LB-agarplaat zonder ampicilline. Na het incuberen van de platen overnacht bij 37 graden Celsius, gebruikt u een steriele pipetpunt om drie tot vier kolonies van de transductieplaat te plukken en deze uit te strekken op een nieuwe LB-agarplaat bevattend 1X ampicilline en 100 microliters van een molaire natriumcitra

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Gevorderde biologie

Microbiology

Microbiologie

using p1 phage to move antibiotic resistance in e. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics.

Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages multiply inside the host cell, disrupt metabolism, lyse the cell, and release new phage particles. Lysogenic phages can also enter a dormant state, where the phage genome integrates into the host genome and may be induced later.

Modern researchers can use this natural process to move genes into bacteria. A gene of interest can be placed in a lysogenic phage genome and then transferred into a recipient bacterium, where it can be expressed. This approach differs from transformation, which uses plasmids, and it can also be more flexible than conjugation because the donor and recipient only need to be permissive to the phage and have the right surface receptors.

After transduction, the recipient cells must be selected to find the ones that received the gene. Researchers can use a marker such as a FLAG-tag or polyhistidine-tag, or they can use the gene's own function, such as antibiotic resistance, for selection. PCR can also confirm the transfer by comparing the target signal with positive and negative controls.

The experiment described here used P1 bacteriophage to move the ampicillin resistance gene from the W3110 strain of E. coli to the J53 strain. The work had two main steps. First, P1 phage carrying the resistance gene was prepared from the donor strain. Second, the phage was used to transduce the gene into the recipient strain.

Successful transfer could then be checked by qPCR, or quantitative PCR. If the transduction worked, J53 would become resistant to ampicillin and the resistance gene would be detected by qPCR. If it did not work, the gene would not be detected, and ampicillin would still stop the J53 strain from growing.

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

using-p1-phage-to-move-antibiotic-resistance-in-e-coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Learn how bacteriophage transduction uses P1 phage to move ampicillin resistance between E. coli strains and how qPCR confirms success.

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli | JoVE K12

Alexander Gold

Tonya M Colpitts

Department of Microbiology

Boston University School of Medicine & National Emerging Infections Diseases Laboratories

Concepts

Preparation of Donor Phage Lysate

Transduction

Data Analysis by Quantitative Polymerase Chain Reaction

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards