Complementary DNA

Overzicht

Alleen genen die worden getranscribeerd in messenger RNA (mRNA) zijn actief of komen tot expressie. Wetenschappers kunnen daarom het mRNA uit cellen halen om genexpressie in verschillende cellen en weefsels te bestuderen. De wetenschapper zet mRNA via omgekeerde transcriptie om in complementair DNA (cDNA). Omdat mRNA geen introns (niet-coderende regio's) en andere regulerende sequenties bevat, stelt cDNA – in tegenstelling tot genomisch DNA – onderzoekers ook in staat om direct de aminozuursequentie te bepalen van het peptide dat door het gen wordt gecodeerd.

cDNA-synthese

cDNA kan op verschillende manieren worden gegenereerd, maar een gebruikelijke manier is om eerst totaal RNA uit cellen te extraheren en vervolgens het mRNA te isoleren van de meer overheersende typen– transfer-RNA (tRNA) en ribosomaal (rRNA). Rijp eukaryoot mRNA heeft een poly(A)-staart – een reeks adenine-nucleotiden – toegevoegd aan de 3’-kernen. eindigen, terwijl andere soorten RNA dat niet doen. Daarom kan een reeks thyminenucleotiden (oligo-dTs) worden vastgemaakt aan een substraat zoals een kolom of magnetische kralen, om specifiek basenparen te vormen met de poly(A)-staarten van mRNA. Terwijl mRNA met een poly(A)-staart wordt gevangen, worden de andere soorten RNA weggespoeld.

Vervolgens wordt reverse transcriptase – een DNA-polymerase-enzym uit retrovirussen – gebruikt om cDNA uit het mRNA te genereren. Omdat reverse transcriptase, zoals de meeste DNA-polymerasen, alleen nucleotiden kan toevoegen aan de 3’ aan het uiteinde van een keten wordt een poly(T)-primer toegevoegd om aan de poly(A)-staart te binden en zo een startpunt voor cDNA-synthese te verschaffen. De cDNA-streng eindigt in een haarspeldlus. Het RNA wordt vervolgens afgebroken – gewoonlijk met alkalibehandeling of RNase-enzymen – waardoor het enkelstrengige cDNA intact blijft.

Een tweede DNA-streng die complementair is aan het cDNA wordt vervolgens gesynthetiseerd door DNA-polymerase - vaak met behulp van de haarspeldlus van de eerste cDNA-streng of een ingekerfd stuk van het mRNA als primer.

Het resulterende dubbelstrengige cDNA kan in bacteriële of virale vectoren worden ingevoegd en worden gekloneerd met behulp van standaard moleculair biologische technieken. Er kan ook een cDNA-bibliotheek–worden gebouwd die alle mRNA's in de cellen of het weefsel van interesse– vertegenwoordigt voor aanvullend onderzoek.