Photo-geïnduceerde verknoping van niet-gemodificeerde eiwitten (PICUP) maakt karakterisering van oligomeer grootte van de distributie in metastabiele eiwitmengsels. Tonen we de toepassing van PICUP aan drie representatieve amyloidogenic peptiden van de 40 - en 42-residu vormen van amyloid β-eiwit, en calcitonine, en een controle peptide groei-hormoon releasing factor.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Photo-geïnduceerde verknoping van ongeschikte Eiwitten (PICUP) Toegepast op Amyloidogenic Peptiden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De assemblage van amyloidogenic eiwitten in toxische oligomeren is een rudimentaire gebeurtenis in de pathogenese van eiwit misfolding ziekten, waaronder Alzheimer, Parkinson en Huntington ziekten, erfelijke amyotrofe laterale sclerose, en type 2 diabetes. Vanwege de metastabiele aard van deze verzamelingen van eiwitten, is het moeilijk om hun oligomeer grootte-verdeling kwantitatief te beoordelen met behulp van klassieke methoden, zoals elektroforese, chromatografie, fluorescentie, of dynamische lichtverstrooiing. Oligomeren van amyloidogenic eiwitten bestaan als metastabiele mengsels, waarin de oligomeren dissociëren in monomeren en tegelijkertijd associate in grotere assemblages. PICUP stabiliseert oligomeer populaties door covalente cross-linking en in combinatie met fractionering methoden, zoals natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) of size-exclusion chromatografie (SEC), PICUP biedt snapshots van het oligomeer grootte distributies die bestond voordat kruis -linking. Vandaar dat PICUP maakt visualisatie en kwantitatieve analyse van metastabiele eiwit bevolking en kan gebruikt worden om de montage en ontcijferen relaties tussen volgorde wijzigingen en oligomerisatie te controleren
Protocol
1. Peptide voorbereiding
- Weeg ~ 100 tot 200 ug van gevriesdroogde peptide met behulp van een microbalans en overdracht in gelabelde, silicium-coating, low-adsorbens microcentrifuge buizen. Hier gebruiken we de menselijke sequenties van Aβ40, Aβ42, calcitonine, en GRF.
- Hier maken we gebruik van peptiden die voorbehandeld zijn met 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) tot homogene, aggregaat-vrije bereidingen te verkrijgen. Deze stap is nodig omdat vooraf gevormde aggregaten induceren snelle aggregatie van amyloidogenic eiwitten, die leiden tot een slechte reproduceerbaarheid onder de experimenten 5. Andere methoden zoals filtratie en ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
PICUP is oorspronkelijk ontwikkeld om een stabiele eiwitcomplexen 2-studie. De methode werd later toegepast op de kwantitatieve studie van metastabiele amyloïde eiwit assemblages, waaronder Aß 10, prion en ziekte-geassocieerde PrP Sc 11, en α-synucleïne 12. De belangrijkste factoren die moeten worden genomen bij het ontwerpen van een PICUP experiment zijn de reagens stoichiometrie, bestraling tijd, en monstervoorbereiding procedure. De eerste twee punten kan verlangen empirische optimalisatie, t.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies AG027818 en AG030709 van NIH / NIA, 2005/2E uit de Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 van de Alzheimer Association, en 07-65798 uit California Department of Public Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W gloeilamp | Overig | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | De warmte die door de lamp wordt gegenereerd d–heeft geen invloed op de monsters bij korte incubatieperioden. |
| 35-mm SLR-camerabody | Instrument | Pentax | SP500-model | In onze opstelling is een balg aan de behuizing van de camera bevestigd om een geschikte kamer te creëren voor bestraling van het monster, dat op 10 cm afstand van de lichtbron is geplaatst. |
| Heldere PCR-buisjes met dunne wanden | Overig | Eppendorf | 951010006 geleverd door Fisher L22-003-24 | |
| Glazen vials (1,8 ml) | Overig | Kimble Chase | 60940A 2, geleverd door Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagens | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagens | TCI America | H0424 | Gebruik in een zuurkast. |
| Aβ40 en Aβ42 | Reagens | Biopolymeerlaboratorium van de UCLA | ||
| Calcitonine | Reagens | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydraat | Reagens | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex tot de oplossing helder is. Dek de RuBpy-buis af met aluminiumfolie om het reagens te beschermen tegen omgevingslicht. RuBpy wordt elke keer vers bereid en moet binnen 48 uur worden gebruikt. |
| Ammoniumpersulfaat | Reagens | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex tot de oplossing helder is. APS wordt elke keer vers bereid en moet binnen 48 uur worden gebruikt. |
| β-mercapto–ethanol | Reagens | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Kan worden gebruikt wanneer SDS-PAGE-analyse wordt uitgevoerd. |
| Novex Tricine SDS-monsterbuffer (2x) | Reagens | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-cel | Instrument | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine-gels (10-20%) | Overig | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS-runbuffer (10x) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Kleuringskit | Invitrogen | LC6100 |
Referenties
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
