Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Samenvatting

Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan ​​dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.

Samenvatting

Grote histocompatibility complex (MHC) klasse II tetrameren kan de directe visualisatie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen door flowcytometrie. Deze methode is gebaseerd op de zeer specifieke interactie tussen peptide geladen MHC en de bijbehorende T-cel-receptor. Terwijl de affiniteit van een MHC / peptide molecuul is laag, cross-linking MHC / peptide complexen met streptavidine verhoogt de aviditeit van de interactie, waardoor het gebruik ervan als kleurstoffen. Vanwege de relatief lage frequenties van de CD4 + T-cellen (~ 1 op 300.000 voor een enkele specificiteit) deze test maakt gebruik van een in vitro amplificatie stap te verhogen de drempel van de detectie. Mononucleaire cellen worden gezuiverd uit perifeer bloed door Ficoll onderlaag. CD4 + cellen worden dan van elkaar gescheiden door negatieve selectie met behulp van gebiotinyleerd antilichaam cocktail en anti-biotine gelabeld magnetische korrels. Met behulp van hechtende cellen van de CD4-cel-fractie als antigeen presenterende cellen, CD4 + T-cellen zijn uitgebreid in de media door het toevoegen van een antigene peptiden-en IL-2. De uitgebreide cellen zijn gekleurd met de bijbehorende klasse II tetrameer door incubatie bij 37 C gedurende een uur en daarna gekleurd met oppervlakte-antilichamen zoals anti-CD4, anti-CD3 en anti-CD25. Na de etikettering, kunnen de cellen direct worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie. De tetrameer positieve cellen vormen meestal een aparte bevolking onder de uitbreiding van CD4 + cellen. Tetrameer positieve cellen zijn meestal CD25 + en CD4 vaak hoog. Omdat het niveau van achtergrond tetrameer vlekken kan variëren, moet positieve kleuring resultaten altijd worden vergeleken met de kleuring van dezelfde cellen met een irrelevante tetrameer. Meerdere variaties van deze fundamentele test zijn mogelijk. Tetrameer positieve cellen kunnen worden gesorteerd voor verdere fenotypische analyse, opname in ELISPOT of proliferatie assays, of andere secundaire testen. Verschillende groepen hebben ook aangetoond dat co-kleuring met behulp van tetrameren en ofwel anti-cytokine of anti-Foxp3 antilichamen.

Protocol

1. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) isolatie

1. Verkrijgen van een bloedmonster - bloed moet worden verzameld in spuiten of bloed buizen en anti-gecoaguleerd met heparine (01:50 ratio) om te voorkomen dat stolling. Verwacht een opbrengst van ongeveer 1 × 10 ⁶ PBMC per ml bloed - ongeveer 40% van die zal worden CD4 positieve (CD4 +) T-cellen.
2. Aliquot het bloed in 50 ml conische buizen, 25 ml per buis. Als het bloed is gescheiden, meng voordat aliquoting om het plasma te verdelen
3. Voeg PBS, waardoor het totale volume tot 40 ml en onderlaag door het opstellen van 11 ml Ficoll, het invoegen in bloed tube, en zorgvuldig verw....

Discussie

Begrijpen van de rol van CD4 + T-cellen in de immuniteit is van fundamenteel belang. Echter, antigeen specifieke CD4 + T-cellen zijn moeilijk te detecteren en het gebruik van traditionele methoden te isoleren. In tegenstelling, MHC klasse II tetrameren kan de directe visualisatie van de CD4 + T-cellen met de gewenste antigen specificiteit. Deze video toont de isolatie, zuivering, en in-vitro-amplificatie van CD4 + T-cellen en de daaropvolgende visualisatie met behulp van tetrameren. Klasse II tetrameren zijn fluorescere.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Biosafety cabinet voor laminaire luchtstroom klasse 2	apparatuur	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	Of equivalent
Conische buis van 50 mL	apparatuur	VWR international	47747-182	Of equivalent
1X PBS (Ca/Mg-vrij)	reagens	Hyclone	SH30028.02	Of equivalent
Ficoll-paque PLUS	reagens	GE Healthcare	17-1440-03	in folie gewikkeld ter bescherming tegen licht
Pipet Aid XP	apparatuur	Drummond Scientific	4-000-101	Of equivalent
Pipet van 10 mL	apparatuur	Corning	CLS4492	Of equivalent
Aerosolve-canisters	apparatuur	Beckman Coulter Inc.	359481	met inzetten van 50 mL
Centrifuge	apparatuur	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	Of equivalent
Transferpipetten	apparatuur	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	Of equivalent
Pasteur-pipetten	apparatuur	VWR international	14672-200	Of equivalent
Hemolytische buffer	reagens	N/A	N/A	8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L dinatrium-EDTA
Trypan blauw	reagens	Sigma-Aldrich	T6146	0,2% in PBS
Hemocytometer	apparatuur	VWR international	15170-208
Conische buis van 15 mL	apparatuur	VWR international	05-527-90	Of equivalent
Running buffer	reagens	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T-cel isolatiekit II	reagens	Miltenyi Biotec	130-091-155	Of equivalent
EasySep® magneet	apparatuur	Stem Cell Technologies	18000
Polypropyleen buis van 5 mL	apparatuur	Falcon BD	352063
RPMI 1640	reagens	Invitrogen	22400-089	met 25 mM HEPES
Gepoold menselijk serum	reagens	N/A	N/A	afgenomen van gezonde donoren, hitte-geïnactiveerd en gefilterd
Pen Strep	reagens	Invitrogen	1570-063	Of equivalent
Flessentopfilter van 500mL 0,22 micron	apparatuur	Nalge Nunc international	595-3320	Of equivalent
Plaat met 48 wells	apparatuur	Costar	3548	Of equivalent
37°C CO2 incubator	apparatuur	Sanyo	MCO-18AIC	Of equivalent
20 mg/mL synthetisch peptide	reagens	N/A	N/A	Maatsynthese van elke peptideleverancier
FACS-buis van 5 mL	apparatuur	Falcon BD	352008	Polystyreen
Peptide-geladen klasse II tetrameer (zoals beschreven)	reagens	N/A	N/A	Voorbereid door de BRI tetrameer core
Anti-CD3	reagens	BD Biosciences	347344	Of equivalent
Anti-CD4	reagens	eBioscience	17-0049-73	Of equivalent
Anti-CD25	reagens	eBioscience	11-0259-73	Of equivalent
Facs Calibur flowcytometer	apparatuur	BD Biosciences	342975	Of equivalent