Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 3 beschrijft het proces van fluorescent labelen van de versterkte RNA uit zowel de gastheer en virale monsters door amino-allyl koppeling van kleurstoffen. Deel 3 van 3.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De familie
Protocol
Deel 1: ARNA etikettering: aminozuren allyl koppeling van de kleurstoffen
- Voeg 1μg van de ARNA monsters in 1,5 ml microcentrifuge buizen.
- Vacuüm droog de monsters op een laag of geen vuur tot ze helemaal droog zijn. Cap elke buis, zodra het droog is - niet Kreukherstellend!
- Voeg 9μl koppeling buffer aan elke buis en resuspendeer de ARNA door voorzichtig vortexen gedurende 1 minuut. Centrifugeer kort aan het monster te verzamelen in de bodem van de buis, en laat het monster zitten op het ijs.
- Voeg 22μl hoge kwaliteit DMSO aan elke buis van Cy3 of Cy5 kleurstof. Een tube van de kleurstof is genoeg voor 2 monsters. De Cy3 kleurstof is voor het labelen van uw referentie monsters, en de Cy5 kleurstof is voor het labelen van de test monsters.
- Vortex de kleurstoffen aan goed te mengen. Houd de kleurstoffen in het donker pas klaar voor gebruik. Niet voor te bereiden kleurstof eerder dan 1 uur voor gebruik. Zorg dat er geen water krijgt in de kleurstof / DMSO mix op elk punt.
- Voeg 11μl van de bereide DMSO / Cy kleurstof aan elk monster. Meng goed door vortexen voorzichtig.
- Incubeer gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur. Bedek de monsters met aluminiumfolie of houd ze in een lade om de blootstelling aan het licht te minimaliseren.
- Na de incubatie, voeg 4.5μl hydroxlyamine aan elk monster om de reactie te doven. Meng goed door vortexen voorzichtig.
- Incubeer gedurende nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur. Bedek de monsters met aluminiumfolie of houd ze in een lade om de blootstelling aan het licht te minimaliseren.
Deel 2: Labeled ARNA clean-up
- Vortex het RNA binden beads kort om een homogene massa te verkrijgen voor gebruik.
- Bereid de ARNA Binding Mix op kamertemperatuur. (Tabel 1)
- Meng goed door vortexen.
- Aliquote Het Arna elutiebuffer in een 1,5 ml buis en incuberen bij 50-60 ° C gedurende ten minste 10 minuten.
- Voeg 70μl van de ARNA binding mix aan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Overdracht van de monsters van de PCR-plaat tot een 96-goed-ronde bodemplaat.
- Voeg 50μl van 100% isopropanol aan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Schud de plaat op een orbitale schudder gedurende minstens 2 minuten grondig mengen van de monsters.
- Verplaats de plaat een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen. Laat de plaat op de stand tot het mengsel wordt transparant en de binding kralen zijn pellets.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant. Het supernatant moeten ofwel een fel roze of een heldere blauwe op dit punt te wijten aan de niet opgenomen kleurstof moleculen.
- Haal de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 100μl ARNA Wash Solution aan elk putje en schud de plaat gedurende 1 minuut op de orbitale schudder bij gematigde snelheid. Korrels kunnen niet volledig uiteen bij deze stap.
- Verplaats de plaat een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant.
- Haal de plaat uit de magnetische stand.
- Herhaal de wasbeurt een 2 e tijd met 100μl ARNA Wash Solution.
- Na de 2 e wassen, drogen de kralen door schudden van de plaat gedurende 1 minuut op de rondschudapparaat op maximale snelheid. Niet Kreukherstellend samples!
- Elueren Het Arna van de kralen door het toevoegen van 20μl voorverwarmde ARNA elutiebuffer aan elk monster.
- Schud de plaat op de orbitale schudder gedurende 3 minuten, daarna moet u controleren of de magnetische korrels zijn volledig verspreid. Zo niet, dan gaan schudden.
- Zodra de magnetische korrels volledig verspreid, verplaatst u de plaat aan een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen. Het supernatant bevat het opgeruimd, gelabeld ARNA monsters, en moet worden ofwel een bleke roze of een lichtblauw.
- Breng voorzichtig de geëlueerd ARNA om een nieuwe PCR-plaat (of PCR-buizen).
- (Optioneel stap) Controleer de RNA-concentratie en de hoeveelheid kleurstof in de monsters door het meten van 1.5μl op een NanoDrop spectrofotometer met behulp van de Microarray module.
- Onmiddellijk hybridiseren de gelabelde ARNA op een microarray platform van uw keuze, of als alternatief, kunt u de gelabelde ARNA bewaren bij -80 ° C tot je klaar bent voor hybridisatie.
Tabel 1 ARNA Binding Mix
| Reagens | Bedrag voor een reactie |
| RNA-Bindende Kralen * | 10μl |
| Bead resuspensie Oplossing * | 4μl |
| 100% isopropanol ** | 6μl |
| ARNA Binding Buffer Concentrate | 50μl |
* Meng de RNA-bindend kralen met dekraal resuspensie oplossing eerst
** Voeg de isopropanol en meng goed voor het toevoegen van de ARNA bindende buffer concentreren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen
Bij het uitvoeren van het amino-allyl koppeling, is het essentieel om de kleurstof hersuspenderen in DMSO kort (minder dan 1 uur) voor het koppelen en er geen water in de kleurstof / DMSO mix, want het zal reageren met de actieve groep van de kleurstof te verzekeren. Niet Kreukherstellend RNA (kan gedroogd worden tot 1-2uL in plaats van volledig droog), en goed in de koppeling buffer resuspenderen. Tijdens de koppeling reactie, houden de reactie in het donker, met af en toe f...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te melden.
Dankbetuigingen
Whitehead Institute Fellows fondsen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagens | GE Healthcare | RPN5661 | Bevat zowel Cy3- als Cy5-kleurstoffen |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Overig | NanoDrop | ND-1000 | Of gelijkwaardige spectrophotometer |
Referenties
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
