Methodenartikel

ES Cell-afgeleide neuro-epitheliale cel culturen

13.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/118

⸱

30 november 2006

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Afleiding van neuro voorlopers uit embryonale stamcellen (ES)-cellen met behulp van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA).

Samenvatting

ES-cellen hebben de potentie om te differentiëren in de cellen van alle kiembladen, waardoor ze een aantrekkelijk instrument voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën. In het algemeen is de differentiatie van ES-cellen volgt het concept om eerst te genereren onvolgroeide stamcellen, die vervolgens kunnen worden uitgedragen en gedifferentieerd tot volgroeide cellulaire fenotypes. Dit geldt ook voor de ES-cel afgeleide neurogenese, waarin de ontwikkeling van zenuwcellen volgt twee belangrijke stappen: Ten eerste, de afleiding en de uitbreiding van onvolwassen neuro precursoren en seconden, hun differentiatie tot volwassen neurale cellen. Een veel voorkomende methode om neurale voorlopercellen te produceren uit ES-cellen is gebaseerd op embryoid lichaam (EB) formatie, waarin de differentiatie van cellen uit alle kiembladen inclusief neuroectoderm onthult. Een alternatief en meer efficiënte methode om neuro-epitheliale cel ontwikkeling te induceren maakt gebruik van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA), die kan worden bereikt door co-kweken van embryonale stamcellen met de schedel beenmerg-afgeleide stromale cellen (1). Beide, EB vorming en SDIA, onthullen de ontwikkeling van de rozet-achtige structuren, die worden verondersteld om neurale buis lijken op-en / of neurale crest-achtige voorouders. De neurale voorlopers kunnen worden geïsoleerd, uitgebreid en verder gedifferentieerd in specifieke neuronen en glia cellen met behulp van bepaalde kweekomstandigheden. We beschrijven hier de generatie en het isolement van deze rozetten in co-cultuur van experimenten met de stromale cellijn MS5 (2-5).

Protocol

Stap 1

  1. Plaat mitomycine-C ggrowth-remde (10 ug / ml voor 2,5 uur) MS5 cellen bij een dichtheid van 70.000 / cm2 op gelatine gecoate (0,01% gedurende 30 minuten) 6 goed platen in de α-MEM media.
  2. Wanneer de cellen worden bevestigd en hebben gevormd een monolaag ('s nachts groei), overschakelen naar SRM.
  3. Handmatig isoleren ES-cel kolonies van de ES-celkweken met behulp van een injectiespuit met een 27 ½ G naald.
  4. Zorgvuldig Tritrurate de kolonies met een 1 ml blauw tip en de plaat bij een lage dichtheid op de MS5 cellen (meestal 2-3 kolonies per 6 wells plaat).

Opmerking: De ES-cellen kunnen ook worden genomen van enzymatische propagatie met collagenase of trypsine.

Stap 2

  1. Groei van de ES-cellen op de MS5 feeders voor 14-21 dagen tot de rozet-bevattende kolonies te vormen.


Let op: Wijzig media vaak. De rozetten zijn meestal op de buitenste randen van de kolonies en hun vorming kunnen sterk worden verbeterd wanneer 300-500 ng / ml Noggin wordt toegevoegd aan de SRM (3). In sommige differentiatie protocollen, kan SRM worden uitgewisseld met N2-A media en aangevuld met groei of andere factoren naar cel specificatie (2-5) te bevorderen.

Stap 3

  1. Isoleren en kies de rozetten met een 27 ½ G naald onder een microscoop.

Opmerking: Vermijd het snijden en het plukken van de MS5 stromale cellen. Als kolonies worden verpakt met rozetten, kan men ook de oorzaak van het hele kolonie.


Stap 4

  1. Aspireren de clusters van rozetten, zorgvuldig tritrurate ze met een 1 ml blauwe tip, en de plaat ze op poly-L-ornithine (0,001%) en fibronectine (1 ug / ml) of laminine (1 ug / ml)-gecoate 6 putten in N2-A media meestal aangevuld met bFGF (20 ng / ml). De rozetten zal hervormen en uitbreiden.

Opmerking: Om overleving van de cel te verbeteren, kan men het bord van de kleine clusters in druppeltjes naar cel dichtheid te verhogen. Deze stap kan ook worden gewijzigd door een aanvulling van de N2-A media met extra groei of andere factoren die de cel-specificatie (2-5) te bevorderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol laat de verschillende stappen in het genereren en het isoleren van neuro-epitheliale cellen van menselijke ES-cellen met behulp van SDIA. De toepassing van deze methode is veelzijdig en is gebruikt in tal van protocollen tot bepaalde neuronen produceren (bijv. 1, 2, 5-9). De rozetten worden verondersteld om neurale buis cellen met een voorste fenotype (2, 5, 10) lijken en ook de neurale lijst voorvaderen (11, 12) bevatten. Bovendien behouden ze een zekere mate van plasticiteit, omdat ze kunnen worden patroon door specifieke fac...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
L-GlutamineGIBCO, by Life Technologies25030
alpha-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
Penicilline/streptomycineGIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Knockout serum replacementGIBCO, by Life Technologies10828
MEM niet-essentiële aminozuuroplossingGIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
N2-A supplementStem Cell Technologies07152
Mitomycine-CSigma-AldrichM0503
Gelatine type-ASigma-AldrichG1890
poly-L-ornithineSigma-AldrichP49570,01% oplossing
LaminineSigma-AldrichL-2020
FibronectineSigma-AldrichF2006
Basale fibroblastengroeifactor (bFGF)Invitrogen13256
1 mL spuit met 27 1/2 G naaldBD Biosciences309623
N2-A mediummediumDMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement medium (SRM)mediumKnockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement + 1% MEM niet-essentiële aminozuuroplossing + 2 mM L-glutamine
α-MEM mediummediumα-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicilline/streptomycine
MS5cellijnstromale cellen
Microscoop
6-well platenvoor weefselkweek

Referenties

  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
  12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ES celdifferentiatieneuroepitheliale cellenvorming van embryo de lichamenstromale cel afgeleide inducerende activiteitrozetachtige structurenisolatie van neurale progenitorcellenco culture experimentenMS5 stromale cellenneurale buisprogenitorsneurale kamprogenitors

Gerelateerde artikelen