Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray

Summary

Het cDNA microarray PtGen2 is ontwikkeld voor genexpressie studies in loblolly pine, P. taeda, En andere naaldbomen. Hier tonen we pre-en post-hybridisatie hanteren en wassen technieken die gebruikt kunnen worden met deze array betere consistentie, verminderde artefacten, en een lagere opbrengst achtergronden.

Abstract

PtGen2 is een kenmerk 26496 cDNA microarray met versterkte loblolly grenen EST's. De array wordt geproduceerd in ons laboratorium voor gebruik door onderzoekers bestuderen van genexpressie in dennen en andere naaldbomen. PtGen2 werd ontwikkeld als een resultaat van onze ontdekking van genen inspanningen in loblolly grenen, en bestaat uit sequenties geïdentificeerd in de eerste plaats van de wortel weefsels, maar ook van de naald en de stengel. ^1,2 PtGen2 is getest door het hybridiseren van verschillende gelabelde Cy-dye conifeer doel cDNA , waarbij zowel versterkt en niet-versterkte indirecte labeling methoden, en ook getest met een aantal van de hybridisatie en het wassen voorwaarden. Deze video richt zich op de behandeling en verwerking van dia's voor en na de pre-hybridisatie, als na hybridisatie, met behulp van enkele aanpassingen aan de procedures eerder ontwikkelde. ^3,4 Ook inbegrepen, in tekst vorm, zijn de protocollen die gebruikt worden voor het opwekken, etikettering en de clean-up van de doelstelling cDNA's, evenals informatie over de software die wordt gebruikt voor de downstream-verwerking van gegevens.

PtGen2 is bedrukt met een eigen afdruk buffer die hoge concentraties van het zout dat kan moeilijk zijn om volledig te verwijderen bevat. De dia's worden eerst gewassen in een warme SDS-oplossing voorafgaand aan de pre-hybridisatie. Na de pre-hybridisatie, worden de dia's krachtig gewassen in een aantal wijzigingen van het water om de verwijdering van de resterende zouten te voltooien. LifterSlips ™ worden vervolgens gereinigd en geplaatst op de dia's en gelabeld cDNA wordt zorgvuldig geladen op de microarray door middel van capillaire werking, die voorziet in een gelijkmatige verdeling van de steekproef over de glijbaan, en vermindert de kans van de zeepbel van oprichting. Hybridisatie van doelstellingen om de array wordt gedaan bij 48 ° C in een hoge luchtvochtigheid. Na hybridisatie wordt een reeks van standaard wasbeurten gedaan op 53 ° C en kamertemperatuur voor langere tijden. Verwerking PtGen2 dia's met deze techniek minder zout en SDS-afgeleide artefacten vaak gezien als de array is minder rigoureus verwerkt. Hybridiserende doelen die afgeleid zijn uit verschillende bronnen conifeer RNA, deze verwerking protocol leverde minder artefacten, minder achtergrond, en op voorwaarde dat een betere samenhang tussen de verschillende experimentele groepen van arrays.

Protocol

(Let op de artikelen 1 tot 4 niet aangetoond in Video)

Voorbereiden van Cy-gelabeld cDNA Target

Wat volgt is het protocol waarin we voor cDNA synthese gebruik van loblolly dennen totaal RNA en indirecte cDNA etikettering voorafgaand aan de hybridisaties microarray. Hoewel een enkele niet-triviale wijzigingen zijn aangebracht, het protocol hieronder is vergelijkbaar met die in de handleiding die bij SuperScript Indirecte van de Invitrogen's cDNA Labeling Kit.

Deel 1: eerste streng cDNA synthesereactie

1. Mix en kort elke kit component draaien voor gebruik.
2. Bereid....

Discussion

PtGen2 is een recent ontwikkeld, op maat cDNA microarray, dat is ontworpen om in de eerste plaats worden gebruikt door de loblolly dennen onderzoeksgemeenschap. Generated voorlopige resultaten tot nu toe hebben aangetoond dat het array een waardevol instrument voor de evaluatie van transcriptionele gebeurtenissen die zich voordoen in respons op droogtestress, evenals bij het ​​toezicht op wijzigingen die tijdens de ontwikkeling van het embryo zich in de maritieme dennen, Pinus pinaster ^5,6 We worden .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pre-hybridization Buffer	Buffer			5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA
Hybridization Buffer	Buffer			30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS
Wash Solution #1	Buffer			1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C
Wash Solution #2	Buffer			0.1X SSC, 0.2% SDS
Wash Solution #3	Buffer			0.1X SSC
Isopropyl Alcohol	Reagent	Sigma-Aldrich	34959-2.5L
50mL Conical Tubes	Other	Falcon BD	352070
15mL Conical Tubes	Other	Falcon BD	352196	Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation
Coplin Jar		Wheaton	900520
Staining Dish & Rack	Other	Wheaton	900200
Albumin from bovine serum (BSA)	Other	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.GF
SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling	Kit	Invitrogen	L1014-02
Turbo DNase	Kit	Ambion	AM1907
System
Cy-5 Dye	Reagent	GE Healthcare	PA25001
Cy-3 Dye	Reagent	GE Healthcare	PA23001
LifterSlips™	Other	Erie Scientific	25X601
HybChambers	Equipment	GeneMachines	JHYB200003