We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Deze methode wordt gebruikt om een hoog moleculair gewicht genomische DNA-extract van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 uM Sterivex filters die zijn behandeld met opslag / lysisbuffer en gearchiveerd bij -80 ° C, en dit met behulp van DNA een cesium chloride dichtheidsgradiënt te zuiveren. Het protocol begint met twee een-uur incubatie stappen om DNA te bevrijden van cellen en te verwijderen RNA. Vervolgens wordt een reeks van Fenol: zijn Chloroform Chloroform en extracties uitgevoerd, gevolgd door centrifugeren aan eiwitten en celmembraan componenten, collectie van het waterige DNA-extract, en een aantal buffer uitwisseling stappen te wassen en te concentreren het extract te verwijderen. Deel vijf beschrijft de optionele zuivering via cesium chloride dichtheidsgradiënt. Het wordt aanbevolen om met minder dan 15 monsters te werken in een keer om verwarring te voorkomen en te bezuinigen protocol tijd. De totale tijd die nodig is voor dit protocol is afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geëxtraheerd. Voor 10-15 monsters en ervan uitgaande dat de juiste centrifugeren apparatuur beschikbaar is, moet deze hele protocol duurt 3 dagen. Zorg ervoor dat u de hybridisatie ovens ingesteld op de temperatuur aan het begin van het proces.
Protocol
Opmerking: Alle gebruikte reagentia in dit protocol zijn gealiquoteerd van het laboratorium voorraden in kleinere werkvoorraden-dit is erg belangrijk om te voorkomen dat kruisbesmetting van je DNA-monsters en besmetting van lab voorraden. Ook, toen pipetteren, zorg ervoor dat pipetpunten te veranderen voor elke aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen.
Deel een: Cell Lysis en Spijsvertering
- Begin dit protocol door het ontdooien van de Sterivex filters die eerder geconcentreerd planktonische biomassa bevatten op het ijs. Voor de eenvoud, hier beschrijven we de procedure voor de verwerking van een apart filter. In de praktijk adviseren wij de verwerking van 16 of minder filters tegelijk.
- Zodra het filter is ontdooid, beginnen de eerste van twee incubaties: een om de cellen te lyseren en te verwijderen RNA, en een af te breken eiwitten. Voor de eerste incubatie, voeg 100 ul lysozym (125 mg in 1000 ui TE) en 20 ml RNase A (10 ug / ml) om de filter. Sluit het filter met Parafilm en laat het in de oven te draaien hybridisatie bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Voor de volgende incubatie, voeg 100 ul proteïnase K en 100 ul 20% SDS aan het filter. Sluit met behulp van Parafilm en laat het aan een tot twee uur meer draaien in de hybridisatie oven, dit keer bij 55 ° C.
- Met behulp van een injectiespuit 5cc, overdracht van de lysaat van de Sterivex filter in een 15 ml Falcon buis. Spoel het filter met 1 ml lysis buffer en voeg de spoel vloeistof om het lysaat in uw Falcon buis met behulp van de 5cc spuit. Nu heb je gelyseerd en verteerd je cellen, bent u klaar om hun DNA te halen.
Deel twee: DNA-extractie
- De volgende stap is om de fenol-chloroform methode te gebruiken om het DNA uit je lysaat. Voeg een gelijke hoeveelheid (ongeveer 3 ml) van fenol: chloroform: isoamylalcohol (IAA) de lysaat buis, en zorg ervoor dat pipetpunten voor elke toevoeging te veranderen om kruisbesmetting te voorkomen. Vortex gedurende 10 seconden goed mengen.
- Spin de buis bij 2500 g gedurende 5 minuten, zorg ervoor dat de centrifuge evenwichtig is. Tijdens het centrifugeren moet de fenol-chloroform-lysaat mengsel scheiden in twee lagen: een organische laag die het fenol, chloroform, en eiwitten uit je monster, op de bodem, en een waterige laag, die bestaat uit je DNA, water en andere meer hydrofiele moleculen, op de top.
- Breng de waterige laag (met daarin uw DNA) in een nieuwe 15 ml Falcon buis. Wees voorzichtig dat u de interface contact met de pipetpunt (laat altijd een kleine hoeveelheid van de waterige laag achter).
- Om deze nieuwe buis, voeg een gelijke hoeveelheid (ca. 3 ml) van Chloroform: IAA, en zorg ervoor dat pipetpunten voor elke toevoeging te veranderen om kruisbesmetting te voorkomen. Vortex gedurende 10 seconden. Deze stap helpt om alle resterende fenol te verwijderen uit uw DNA-monster.
- Spin bij 2500 g gedurende 5 minuten of tot waterige laag is duidelijk. Overdracht waterlaag in een nieuwe, label Falcon buis en voeg 1 ml van TE bij pH 8,0, zorg dat u de interface contact met de pipetpunt (laat altijd een kleine hoeveelheid van de waterige laag achter). Deze waterige laag bevat uw DNA-extract.
Deel drie: DNA Concentratie en Wassen
- De volgende stap is te wassen en het DNA-monster te concentreren in een 15 ml Amicon Ultra centrifugebuis. De Amicon buizen bestaan uit een filter dat moleculen blijft op of boven een bepaald moleculair gewicht (het retentaat) en een buis om de stroom-door middel van vangstbeperkingen (het filtraat). In dit geval, het filter houdt je DNA (het retentaat). Breng uw DNA-extract van stap 2.5 om de filter compartiment van een Amicon Ultra buis.
- Draaien op 3500 g gedurende 10 minuten. Controleer of er minder dan 1 ml vloeistof bewaard in de Amicon filter. Als er meer retentaat blijft, vul het filter met TE en weer draaien. Zorg ervoor dat u een frisse pipettip gebruiken voor iedere TE aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen.
- Verwijder de doorstroming, of het filtraat, naar een andere Falcon buis en sla het op in de koelkast totdat u bevestiging van uw uiteindelijke DNA product op een gel (vierde deel).
- Voeg 2 ml TE-buffer om de Amicon filter en draaien op 3500 g gedurende 6 minuten, zorg ervoor dat u een frisse pipettip gebruiken voor elke TE aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen. Zwembad filtraat met die uit stap 3.3 en sla in de koelkast.
- Was het DNA twee keer meer met TE voor een totaal van drie wasbeurten (zorg ervoor dat u altijd een verse pipetpunt), en het opslaan van het filtraat elke keer (volgens de stappen 3.3 en 3.4). Voor de laatste was, spin tot 200 tot 500 ml van het retentaat blijft in de Amicon filter. Noteer het uiteindelijke volume en de overdracht van het retentaat (met uw DNA) om een gelabeld 1,5 ml Eppendorf buis.
Deel vier: Bepaling van de DNA-Quality
- Controleer de DNA-kwaliteit en een schatting van de concentratie van het DNA door het uitvoeren van uw monsters op een gel 0,8% agarosegel staINED met 1 ml ethidiumbromide (EtBr) 's nachts. (Wees uiterst voorzichtig bij het gebruik van EtBr-it is een bekend mutageen en verdacht carcinogeen. Zorg ervoor dat je vaak veranderen handschoenen en EtBr over te dragen aan de rest van het lab en om uw huid te voorkomen.) Laad de monsters naast DNA ladders, die dienen als omvang en intensiteit normen (zie volgende stap).
- In de eerste paar rijstroken, belasting ladders met bands van verschillende molecuulgewichten en concentraties. Wij bevelen de volgende lading patroon: in de eerste en laatste rijstroken (buitenste rijstroken), load 10 ul van 50ng/μl van 1kb + of 2log ladder. In de lanen 2,3 en 4, belasting 2 pl, 5 ul, en 10 ul, respectievelijk van 50ng/μl λHindIII ladder. Ten slotte, last 5 ul per rijstrook van de DNA-extract met kleurstof voor elk monster.
- Laat de gel op 15 volt voor ongeveer 16 uur (wij raden 's nachts lopen).
- De volgende dag, de foto van de gel met een UV-gel documentatiesysteem. Voor het bepalen van het moleculair gewicht bereik van je DNA en de concentratie, vergelijk het monster bands bands van de ladders. Goede kwaliteit DNA zal een hoog molecuulgewicht (> 36kb), en tonen weinig tekenen van scheren / degradatie. Zie figuur 1.
Vijfde deel: Cesium Chloride Gradient Centrifugeren
- Als de DNA-kwaliteit is goed en de hoeveelheid voldoende is, kunt u overgaan tot het DNA te zuiveren door het uitvoeren van een cesium chloride (CSCL) gradiënt centrifugatie. Merk op dat deze zuivering stap is optioneel en is niet noodzakelijk voor alle downstream toepassingen (bijvoorbeeld als je wilt fosmid bibliotheken u DIENT te zuiveren genereren, terwijl als je gewoon wilt PCR-reacties uit te voeren, de zuivering is meestal niet nodig). Ten eerste label een centrifugebuis voor elk monster.
- Aan elke centrifugebuis, voeg 160 mg CsCl, 178 pl van genomisch DNA. Na het toevoegen van CsCl en DNA aan de buis, leg een klein stukje van parafilm op de top van de buis en voorzichtig omkeren van de buis tien tot twintig keer in om de componenten te mengen. Gaan niet samen door pipetteren, wat kan leiden tot afschuiving van het DNA. Voeg vervolgens 10 ui van 10 ug / ul EtBr om deze buis en meng dit op dezelfde manier. (Wees uiterst voorzichtig bij het gebruik van EtBr-it is een bekend mutageen en verdacht carcinogeen. Zorg ervoor dat je vaak veranderen handschoenen en EtBr over te dragen aan de rest van het lab en om uw huid te voorkomen.)
- Zorg ervoor dat het gewicht van de buizen zijn afgesloten vóór centrifugeren zodanig dat het gewicht verschillen tussen de buizen zijn minder dan 1 mg.
- Plaats de buizen in de rotor met behulp van hemostaat, sluit het deksel en plaats de rotor in de ultracentrifuge.
- Sluit de ultracentrifuge deur. Vacuüm wordt zodra je de deur dicht worden toegepast. Lopen 's nachts op 100.000 toeren per minuut gedurende 18 uur en 20 ° C.
- Wanneer wordt gecentrifugeerd is voltooid, nemen de buizen van de rotor met behulp van hemostaat en leg ze op een buis rek.
- Visualiseer het DNA met blauw licht transilluminator, of indien niet beschikbaar, gebruik lange golflengte UV-licht, in een donkere kamer. Draag een paar oranje filter bril om de DNA-band te zien. Zie figuur 2.
- Met behulp van een steriele 1cc spuit en naald (26G 5 / 8), verwijder DNA-band en plaats deze in een 1,5 ml Eppendorf buis.
- Om u te helpen herstellen de meeste van de DNA opgesloten in de dode ruimte in de spuit, spoel spuit met 100 pi TE en voeg de gespoeld oplossing voor de buis. Bereid een buisje met 100 pi TE-buffer per monster, om kruisbesmetting te voorkomen.
- Voor het verwijderen van EtBr uit het DNA, voeg een gelijk volume van water verzadigde butanol aan de buis, keren de buizen voorzichtig tien tot twintig keer, centrifugeer bij 10000 rpm gedurende 1 minuut en gooi de bovenste laag.
- Herhaal het wassen totdat de kleur van butanol is transparant, 3 - 4 keer.
- Plaats 4 ml TE in een Amicon Ultra centrifugebuis en voeg de DNA-oplossing van bovenaf.
- Centrifugeer bij 3500 g bij kamertemperatuur, totdat het DNA volume is gereduceerd tot ongeveer 100-500 ui (ongeveer 6-7 minuten) en gooi de doorstroming.
- Voeg 2 ml TE aan Amicon filter en centrifugeer bij 3500 g gedurende 6 minuten, zorg ervoor dat u een frisse pipettip te gebruiken voor elke toevoeging om kruisbesmetting te voorkomen. Tweemaal herhalen.
- Concentreren tot een eindvolume van 50-100 ul door extra centrifugeren als nodig en breng de DNA-oplossing op het filter om een nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis.
- Voeg 40 ul TE aan de Amicon filter en pipet op en neer langs beide filter membranen uit te spoelen eventuele resterende DNA. Voeg deze oplossing toe aan de buis in 5.15.
- Plaats een Microcon YM-30 filter-eenheid in een Microcon buis en voorwas de Microcon door de toevoeging van 200 ul geautoclaveerd water en centrifugeren bij 10000 rpm gedurende 7 minuten.
- Voeg de DNA-oplossing van 5,16 voor de voorwas Microcon om verder te concentreren het DNA. Centrifugeer bij 5.000 tot 10.000 g gedurende 1 - 3 minuten. Controleer de hoeveelheid vloeistofop het filter en herhaal centrifugeren totdat het bedrag van de vloeistof op het filter wordt teruggebracht tot ongeveer 50 pi.
- Plaats het filter op zijn kop in een nieuw Microcon buis en centrifugeer bij 1000 g gedurende 3 minuten. De ideale hoeveelheid geconcentreerde oplossing van 50-60 ul.
- Meet en noteer de concentratie van het DNA op een Nanodrop en controleer piek kwaliteit (moet worden 260nm).
- Overdracht van een kleine hoeveelheid van het DNA een schoon eppendorfbuisje voor de werkvoorraad en bevriezen bij min 20. Breng de rest van het DNA om een tweede schone Eppendorf en bevriezen bij min 80.
Representatieve resultaten:
Wanneer dit protocol goed wordt gedaan, moet u een gel afbeelding te zien na stap 4.4 bij de bepaling van de DNA-kwaliteit vergelijkbaar is met een figuur. Werkelijke DNA-concentratie van extracten zal variëren afhankelijk van de bron van het monster. Na stap 5.7 in CsCl gradiënt centrifugatie, moet genomisch DNA verlicht door blauw licht lijken op figuur 2.
Figuur 1. 0,8% agarosegel elektroforese beeld van een hoog moleculair gewicht DNA verzameld uit vier diepten in de subarctische Stille Oceaan (in tweevoud), gekleurd met de intercalerende stof ethidiumbromide (10 mg / ml). Gel werd uitgevoerd bij 15V voor ~ 16 uur in 1x TBE gel lopen buffer. Monster banden zijn van goede kwaliteit met weinig bewijs van mechanische afschuiving (toont enkele bands of vlekken in tegenstelling tot meerdere bands), hoewel de 10m extracten behouden sommige RNA-overdracht (zie uitstrijkje in de 0,5 tot 2,0 Kb bereik).
Figuur 2. Genomic DNA-band verlicht door blauw licht na CsCl gradiënt centrifugatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Afhankelijk van het aantal monsters dienen te worden verwerkt, kan dit een tijdrovende procedure als gevolg van de twee een uur incubatie stappen, en de herhaalde wast en centrifugeren stappen. Het beste is om twee hele dagen voor deze procedure van plan om veel tijd te verlaten. Als er problemen zijn het krijgen van het uiteindelijke extract volume in de Amicon buis naar beneden te reduceren tot 200-500μl tijdens de DNA-concentratie en het wassen, probeer dan extra TE wast en centrifugations (herhaling deel drie) tot d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada te bedanken voor de ondersteuning van lopende studies op een laag zuurstofgehalte regio's van kust-en open water van de oceaan. JJW werd ondersteund door beurzen uit NSERC en DAW werd ondersteund door beurzen uit NSERC, Killam en de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie. SL werd gesteund door de stichting gefinancierd TULA Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 cc spuit (26G5/8 naald) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml spuit (26G5/8 naald) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1,5 ml Eppendorf-buisjes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15 ml buisjes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5 cc spuit | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 centrifugale filterapparaten | EMD Millipore | UFC801096 | 10.000 nominale moleculaire gewichtsgrens |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Maak het waterverzadigd (butanol:water = 1:1) |
| Centrifugerotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cesiumchloride | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Ethidiumbromide (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Ethylendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridisatieoven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysisbuffer | 0,75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3) | ||
| Lysozym | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 centrifugale filtereenheid | EMD Millipore | 42410 | 50 bp afsnijpunt |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Fenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ blauw licht transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| Natriumlaurylsulfaat (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex-filters | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tafelcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE-buffer, pH 8,0 | |||
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ultracentrifugerotor, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultracentrifugebuis (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Rek voor ultracentrifugebuisjes | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
Referenties
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
