Method Article

Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

DOI:

10.3791/1387

⸱

September 23rd, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bouw van een fosmid bibliotheek met milieu-genomisch DNA geïsoleerd uit de verticale diepte continuüm van een seizoensgebonden hypoxische fjord is beschreven. De resulterende kloon bibliotheek is geplukt in de 384-wells platen en gearchiveerd voor downstream-sequencing en functionele screening door de toepassing van een geautomatiseerd kolonie picking systeem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De overgrote meerderheid van micro-organismen in de natuur op dit moment ontoegankelijk blijven voor de traditionele teeltmethoden. In het afgelopen decennium, de cultuur-onafhankelijke milieu-genoom (

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosmid bibliotheek bouw is verdeeld in vier belangrijkste stappen en onderverdeeld in verschillende delen (zie figuur 1 voor een overzicht).

Stap I (zie protocol "DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex filters" [3])

Deel 1: Enzyme-gekatalyseerde cel lysis

Deel 2: Zuivering van milieu-DNA door CsCl dichtheidsgradiënt centrifugeren en DNA herstel

Deel 3: Kwaliteitscontrole van geëxtraheerde DNA door gelelektroforese

Stap II

Deel 1: enzymatische modificatie stappen van teruggewonnen milieu-DNA

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een procedure wordt beschreven hoe u de meest efficiënte wijze een grote insert fosmid bibliotheek met genomisch DNA afgeleid uit een kust watermonster te genereren. Up-stream genomisch DNA-extractie wordt beschreven in een apart protocol [3].

Omdat de fosmid-bibliotheek is een productie van meerstaps-proces, plan minstens twee tot drie weken op tijd voor de hele procedure, inclusief alle vier gepresenteerde stappen. De winning van genomisch DNA is de meest cruciale stappen en alle down-stre.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Ik heb niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada te bedanken voor de ondersteuning van lopende studies op een laag zuurstofgehalte regio's van kust-en open water van de oceaan. MT en SL werden ondersteund door beurzen uit het TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie (CMDE). MT kreeg ook fellowship steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production KitEpicentre BiotechnologiesCCFOS110sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque AgaroseCambrex50100
stirring hot plateCorningPC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pumpBio-Rad
λ DNA-HindIII DigestNew England BiolabsN3012S
MidRange I PFG MarkerNew England BiolabsN3551S
10,000X SYBR GoldInvitrogenS11494
microwavable plastic wrapSaran premium wrap
Safe Imager transilluminatorInvitrogenS37102
GELase Agarose Gel-Digesting PreparationEpicentre BiotechnologiesG09100
scalpelFisher Scientific08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membraneEMD MilliporeUFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore42410
nuclease free waterAmbionAM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*#InvitrogenP7589
digital dry block heaterVWR international12621-088
water bathVWR international14231-854
centrifugeBeckman Coulter Inc.Avanti J-E
centrifuge rotorBeckman Coulter Inc.JA 5.3
table top centrifugeEppendorf5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clearAxygen ScientificMCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific430052
Step III
LB brothFisher ScientificBP 1426-2
MgSO4Sigma-AldrichM2643
phage dilution buffer10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vialsFisher Scientific430488
Step IV
96 well plate with lidFisher ScientificCS003370(3370)
384 well plate with lidFisher Scientific07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm HFisher Scientific08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmHFisher Scientific08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mmVWR internationalCABD351040
glycerolSigma-AldrichG5516
chloramphenicolSigma-AldrichC0378
LB brothFisher ScientificBP 1426-2
Difco AgarBD Biosciences214530
glass beadsFisher Scientific10-310-1
QFill3GenetixX3050
BleachJavex
EthanolSigma-AldrichE7023
15 mL centrifuge tubesFisher Scientific430052
QPix colony pickerGenetixQPix2
picking head (E. coli) GenetixX4006

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Environmental Genomic LibraryFosmid Library ProductionPulsed Field Gel ElectrophoresisDNA End RepairGel ExtractionPhage PackagingAutomated Colony PickingChloramphenicol SelectionEPI300T1 Resistant CellsQpix2 Robot

Related Articles