RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

Samenvatting

De isolatie van hoge kwaliteit, intact RNA is een essentiële stap in veel laboratoria protocollen. Hier laten we zien RNA-extractie uit hele zebravis embryo's en cDNA synthese voor verdere toepassing in de verschillende experimentele procedures, zoals het gen expressie microarray analyse.

Samenvatting

Veel belangrijke en complexe laboratorium procedures vereisen een inzet van hoge kwaliteit, intact RNA. Een gedegradeerde monster of de aanwezigheid van onzuiverheden kan leiden tot rampzalige resultaten in downstream experimentele toepassingen. Het is daarom van het grootste belang om solide technieken te gebruiken met tal van waarborgen en kwaliteitscontroles voor een superieure steekproef te waarborgen. Hierin hebben we detail een protocol om totaal RNA te isoleren uit embryo's met behulp van hele zebravis een commercieel verkrijgbare chemische denatureringsmiddel en de daaropvolgende opruimen om sporen van DNA en onzuiverheden met behulp van een commercieel RNA isolatie kit te verwijderen. Als RNA is relatief onstabiel en gemakkelijk vatbaar zijn voor splitsing door RNAses, de meeste protocollen test expressie van genen met behulp van een cDNA-product dat rechtstreeks wordt gesynthetiseerd uit een RNA template. We detail een procedure om RNA om te zetten in de meer stabiele cDNA product met behulp van een commercieel verkrijgbare kit. Gedurende deze procedures zijn er tal van kwaliteitscontroles om ervoor te zorgen dat het monster niet wordt afgebroken of verontreinigd is. Het eindproduct van deze protocollen is cDNA die geschikt is voor microarray analyse, RT-PCR of lange-termijn opslag.

Protocol

Deel 1: Extractie van Totaal RNA met behulp van TRIzol Reagent

Bij het werken met RNA is het zeer belangrijk om te werken in een omgeving die vrij is van RNAses. Eenvoudige voorzorgsmaatregelen zoals het hebben gereserveerd pipetten voor gebruik met RNA procedures en spuiten van het werkgebied met een ontsmettend middel reagens (bijv. RNAse Away) voordat het begin van de procedure zijn erg behulpzaam.

1. Om een ​​voldoende hoeveelheid RNA zwembad 50 zebravis embryo's te bereiken in een 1,5 ml microfugebuisje en verwijder zo veel mogelijk water met een pipet.
2. Onmiddellijk voeg 250 ul van TRIzol reagens ¹ tot en met de microfugebuis met de embryo's. TRIzol reagens bevat fenol en mag alleen worden gebruikt onder een zuurkast.
3. Lyseren en homogeniseren van de embryo's met een pellet stamper (ongeveer 20 slagen) totdat het weefsel voldoende is verstoord.
4. Wanneer de cellen voldoende gehomogeniseerd, voeg 750 ul TRIzol reagens tot een totaal volume van 1 ml gelijk.
5. Toe te staan ​​volledige dissociatie van de nucleoproteïne complexen, incubeer gehomogeniseerde monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. In dit stadium kan het monster worden flash ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C of het protocol kan worden voortgezet.
6. Om door te gaan voegen 0,2 ml chloroform en rock de buis gedurende 15 seconden om te mengen.
7. Incubeer het monster gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
8. Het mengsel wordt gescheiden in een lagere rode fenol-chloroform fase, een interfase, en een kleurloze bovenste waterige fase. De bovenste waterige fase bevat het RNA. De bovenste laag moet bestaan ​​uit ongeveer 60% van het oorspronkelijke volume van TRIzol (ongeveer 0,6 ml). Breng de bovenste waterlaag in een nieuwe microfugebuis met behulp van een 1 ml pipet dat evenwel niet tot een van de interfase laag over.
9. Het neerslaan van de RNA voeg 0,5 ml isopropanol.
10. Laat het monster bij kamertemperatuur zitten voor 10 minuten en dan is het monster centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C. RNA vormt een gel-achtige pellet op de bodem van de buis.
11. Zonder de pellet te verstoren, de bovenstaande vloeistof met een pipet en was het pellet in 1 ml 75% ethanol. Meng het monster door voorzichtig omkeren en centrifugeer bij 7500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
12. Na het centrifugeren, wordt de ethanol met een pipet en laat monster drogen terwijl het omgekeerde voor 10 minuten.
13. Resuspendeer de pellet door het toevoegen van 100 pi van RNAse-vrij water en incubeer het monster bij 55 ° C gedurende 10 minuten. Het wordt aanbevolen om regelmatig de vinger vortex tijdens de incubatie om te helpen bij RNA rehydratatie. Optioneel kunt u controleren sample kwaliteit en hoeveelheid met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer of direct doorgaan met de volgende stap.

Deel 2: RNA opruimen met behulp van de Qiagen RNeasy Mini Kit

De Qiagen RNeasy Mini Kit ² is nuttig in het verwijderen van vuil en onzuiverheden van een RNA monster geïsoleerd van andere methoden. Voor deze procedure zijn de β-mercaptoethanol, ethanol, en nuclease-vrij water die nodig zijn in aanvulling op de onderdelen in de kit. Een optionele DNAse behandeling wordt aanbevolen tijdens deze procedure.

1. Bij het eerste gebruik van de kit, zal Buffer RPE moeten worden voorbereid door het toevoegen van vier volumes van 100% ethanol tot een volume van Buffer RPE.
2. Op de dag van de procedure, zal Buffer RLT moeten vers worden bereid. Bereken het totale bedrag van de Buffer RLT die nodig zullen zijn. Een volume van 350 ui is nodig per monster. Ter voorbereiding Buffer RLT, voeg 10 ul van β-mercapto-ethanol voor elke 1 ml buffer. Dit dient te gebeuren onder de zuurkast.
3. Aan elk monster toe te voegen 350 pi buffer RLT en 250 pl van 100% ethanol. Meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
4. Breng het monster, die ongeveer 700 ul, worden in een RNeasy kolom die is in een 2 ml collectie buis en centrifugeer geplaatst bij 8.000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
5. Na centrifugeren, gooi de stroom door en voeg 700 ul van de Buffer RW1 om een ​​RNeasy draaien kolom.
6. Centrifugeer het monster bij 8000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en gooi het doorstromen.
7. DNAse behandeling met Qiagen RNAse-Free DNAse Kit: DNAse behandeling is optioneel, maar wordt ten zeerste aanbevolen voor de hoogste kwaliteit monsters.
   1. Wanneer u voor het eerst de DNAse behandeling kit te ontvangen, moet u de DNAse I stockoplossing voor te bereiden door het toevoegen van 550 pi nuclease-vrij water aan de DNAse. Meng voorzichtig door het omkeren en niet vortex. Aliquot in injectieflacons voor eenmalig gebruik met 10 ul van de stockoplossing. U kunt de voorraad-oplossing bij -20 ° C gedurende maximaal 9 maanden. Het ontdooide porties kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 6 weken, indien nodig, maar niet de fracties opnieuw invriezen na het ontdooien.
   2. Ter voorbereiding op het DNAse I incubatie mix toe te voegen 70 ul buffer RDD tot 10 ul DNAse I stock oplossing per monster. Meng door zachtjes te omkering en centrifugebuis kort om de resterende vloeibare vorm het verzamelen van de zijkanten van de buis. Voeg 80 ul DNAse I incubatie mix direct naar de RNeasy draaien kolom. Incubeer de DNAse behandeling gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
8. Naar aanleiding van de behandeling toe te voegen DNAse 350 ul buffer RW1 met de spin kolom en centrifugeer bij 8000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
9. Na het centrifugeren gooi de stroom door en voeg 500 ul buffer RPE om de spin kolom. Incubeer monster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
10. Centrifugeer steekproef bij 8.000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en gooi de doorstromen.
11. Na het centrifugeren voeg 500 ul 75% ethanol om de spin kolom.
12. Herhaal centrifugering bij 8.000 xg, maar gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
13. Na het centrifugeren gooi de stroom door en laat de kolom om te drogen gedurende 5 minuten.
14. Onmiddellijk centrifuge bij 8.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur aan een links te verwijderen meer dan sporen van ethanol.
15. Na het centrifugeren is volledige overdracht van de spin kolom in een nieuwe 1,5 ml collectie buis en voeg 10 ul nuclease-vrij water. Incubeer gedurende 1 minuut en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Het RNA wordt in de stroom door.
16. Voeg nog een 10 ul van nuclease-vrij water aan de spin kolom en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Centrifugeer steekproef bij 10.000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
17. Na het centrifugeren verwijderd en gooi de spin kolom. RNA zal in het doorstromen.
18. Controleer de kwantiteit en kwaliteit van het RNA met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant.
19. Daarnaast loopt een denaturerende gel of gebruik een Agilent 2100 bioanalyzer om de integriteit van het RNA te controleren.
20. De monsters moeten worden bewaard bij -80 ° C tot cDNA synthese kan worden uitgevoerd.

Deel 3: cDNA synthese met behulp van de Invitrogen SuperScript First-Strand-systeem

RNA is gemakkelijk vatbaar voor splitsing door RNAses leidt tot de degradatie. Als gevolg hiervan veel genexpressie protocollen zijn ontwikkeld om een ​​meer stabiele cDNA product dat rechtstreeks is gesynthetiseerd uit het RNA te gebruiken. Hier hebben we detail synthese van de eerste streng cDNA met behulp van de Invitrogen SuperScript eerste streng synthese systeem ^3. Elke cDNA-synthese reactie kan maximaal 5 ug RNA.

1. Voor aanvang van de procedure mix en een korte centrifuge elke component.
2. Bereid RNA / primer mengsel in een steriele 0,5 ml microfugebuisje zoals aangegeven in tabel 1.
3. Incubeer het monster bij 65 ° C gedurende 5 minuten.
4. Onmiddellijk overdracht monster ijsslurrie gedurende 10 minuten.
5. Terwijl het monster is koeling voor te bereiden een master mix met de componenten die in tabel 2. De volumes staan ​​per 1 reactie. Dienovereenkomstig aan te passen volumes voor het totale aantal van de reacties.
6. Voeg na afkoelen 9 ul van de master mix bereid in stap 5 voor elke RNA / primer mengsel. Meng voorzichtig en verzamel door korte centrifugeren. Het totale volume van elk monster moet 19 ul worden.
7. Incubeer monster op 42 ° C gedurende 2 minuten in een thermocycler.
8. Voeg 1 ui (50 stuks) van Superscript II RT aan elke buis, mengen, en incuberen bij 42 ° C gedurende 60 minuten in een thermocycler.
9. Beëindig de reactie bij 70 ° C gedurende 15 minuten en dan chill monster tot 4 ° C. Een thermocycler kan geprogrammeerd worden voor de stappen 8 en 9.
10. Nadat het monster heeft bereikt 4 ° C en breng de reactie op een ijsbad.
11. Op het ijs toe te voegen 1 pl RNAse H aan elke buis en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Het totale volume is nu 21 pl. Toevoeging van RNAse H om uw monster zal degraderen de RNA-sjabloon en laat alleen de enkele streng cDNA product.

Deel 4: cDNA Isolatie en Neerslag

1. Een 1,5 ml fase lock-gel tube zal worden gebruikt in de isolatie van het cDNA product. Bereid een 1,5 ml fase lock-gel buis door middel van centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 2 minuten. De gel moeten allemaal op de bodem van de buis.
2. Voeg 81,5 ul fenol (Tris-verzadigd, gebufferd tot pH 8,0), 81,5 ul van 24:1 chloroform isoamylalcohol, en het monster (21 ul) in de fase slot gel buis. Meng een paar keer door voorzichtig omkeren.
3. Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. De cDNA moet in de bovenste waterige fase. Breng de bovenste fase over in een schone 1,5 ml microfugebuis. Het totale volume moet rond de 20 pl.
5. Voeg 1X volume van 3 M NaOAc, pH 5,2 en meng voorzichtig. Bijvoorbeeld, als het volume van de bovenste waterige fase was gelijk aan 20 ul, moet u twee ui van 3 M NaOAc, pH 5,2 toe te voegen.
6. Voeg 7 pl van 5 mg / ml glycogeen en meng voorzichtig.
7. Voeg 1X volume isopropanol toe en meng voorzichtig. Meestal is dit ongeveer 30 ul van isopropanol.
8. Laat monster incuberen bij kamertemperatuur Temperatuure gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
9. Een kleine cDNA pellet moeten vormen op de bodem van de buis. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet.
10. Voeg 500 ul van 70% ethanol en meng door inversie.
11. Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 5 minuten.
12. Na het centrifugeren de bovenstaande vloeistof met een pipet en herhaal de 70% ethanol wassen en centrifugeren (stap 10 en 11).
13. Na het centrifugeren de bovenstaande vloeistof met een pipet. Als er vloeistof die op de zijkanten van de buis, kan deze worden verzameld door kort draaien van de buis. Verwijder eventuele overtollige vloeistof en laat de pellet op kamertemperatuur drogen gedurende 5 minuten.
14. Voeg 20 ul van nuclease-vrij water op de korrel te hydrateren. Plaats het monster bij 55 ° C gedurende 5 minuten voor rehydratatie van de pellet.
15. De kwantiteit en kwaliteit van de cDNA product wordt vervolgens gecontroleerd met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant. De cDNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C.

Representatieve resultaten

Na de RNA opruimen, kan ongeveer 15 microgram van hoge kwaliteit totaal RNA worden verwacht van 50 zebravis embryo's. Voor de beoordeling van totaal RNA kwaliteit, een spectrofotometer, gel elektroforese, en een Agilent 2100 Bioanalyzer kan worden gebruikt. Een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer kan worden gebruikt om de absorptie te beoordelen bij 260 nm in vergelijking met de absorptie bij 280 nm (figuur 1). De A ₂₆₀ / _{A-280-verhouding} kan onthullen de aanwezigheid van verontreinigingen en geven het bewijs van mogelijke afbraak. Een A ₂₆₀ / A-ratio van ₂₈₀ 1.9-2.0 wordt aanvaardbaar geacht. Bovendien is het sterk aanbevolen dat een RNA-denaturatie gel worden uitgevoerd om RNA integriteit te beoordelen. RNA-strengen zal scheiden op basis van hun grootte, met kleinere strengen migreren verderop in de gel. Een niet-aangetaste monster zal verschijnen als een uitstrijkje met twee sterke bands. Het uitstrijkje is een gevolg van een populatie van verschillende grootte mRNA strengen en de banden komen overeen met 28S en 18S rRNA. De 28S band moet ongeveer twee keer zo intens als de 18S band (figuur 2). Als alternatief kan totaal RNA integriteit worden beoordeeld met behulp van een Agilent 2100 bioanalyzer. Twee verschillende pieken van de 28S en 18S rRNA wordt verwacht (figuur 3). De 28S piek moet groter zijn dan de 18S piek met het gebied onder de pieken ongeveer 2:1, respectievelijk. Twee verschillende pieken worden niet waargenomen in afgebroken monsters. RNA monsters vertonen degradatie mag niet worden uitgeoefend door middel van de volgende experimentele procedures.

Spectrofotometrische analyse kan worden gebruikt om de kwaliteit van het cDNA product (figuur 4) te beoordelen. De A ₂₆₀ / _A-280 moet rond de 1,8. cDNA reacties met een inzet van 5 pg totaal RNA routinematig opbrengst 1-2 ug van cDNA product in ons laboratorium.

Figuur 1. Een NanoDrop spectrum van RNA monster. Na RNA opruimen, kan RNA hoeveelheid en de kwaliteit worden beoordeeld met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer. Ongeveer 15 ug van hoge kwaliteit totaal RNA wordt routinematig verkregen van 50 zebravis embryo's met een A ₂₆₀ / _A-280-ratio rond 1,9-2,0.

Figuur 2. Een RNA-denaturatie gel. Om de integriteit van het totale RNA isolatie, kan een RNA-denaturatie gel worden liep. Een uitstrijkje met twee heldere bands die overeenkomen met 28S en 18S rRNA wordt verwacht. De 28S band moet ongeveer twee keer zo intens als de 18S band.

Figuur 3. Een spoor van een RNA-monster van een bioanalyzer. Om de integriteit van het totale RNA-isolatie te beoordelen, kan ook monsters worden geanalyseerd op een Agilent 2100 bioanalyzer. Twee scherpe pieken, die overeenkomen met de 28S en 18S rRNA, zichtbaar moet zijn. De 28S piek moet groter zijn dan de 18S piek met het gebied onder de pieken ongeveer 2:1, respectievelijk.

Figuur 4. Een NanoDrop spectrum van een cDNA monster. Spectrofotometrisch onderzoek met een NanoDrop ND-1000 kan worden gebruikt om de hoeveelheid en de kwaliteit van het cDNA product te beoordelen. De A ₂₆₀ / _{A-280-verhouding} moet rond de 1,8. cDNA reacties met een inzet van 5 ug totaal RNA routinematig opbrengst 1-2 ug van cDNA in ons laboratorium.

Tabel 1. Componenten om voor RNA / primer mengsels toe te voegen bij stap 2 van de cDNA synthese.

Bestanddeel	Volume
Totaal RNA (tot 5 ug)	10 pi
10 mM dNTP mix	1 pi
Oligo (dT) 12-18 (0,5 pg / pl)	1 pi
DEPC-behandeld water	n ul
Totale volume	10 pi

Tabel 2. Reactiemengsel voor stap 5 van de cDNA synthese. Vermeld volumes zijn per reactie. Verhoging van volumes van elk bestanddeel voor het totale aantal reacties.

Bestanddeel	Volume
10X RT Buffer	2 pi
25 mM MgCl2	4 pl
0,1 mM DTT	2 pi
RNAseOUT	1 pi

Discussie

De kwetsbaarheid van het RNA-molecuul is de meest kritische overweging dat mag niet worden vergeten in dit protocol. Steriel apparatuur die is RNAse-vrij moet altijd worden gebruikt in een RNAse-vrije zone van het laboratorium. Het is nuttig te reserveren een deel van het laboratorium te worden gebruikt voor RNA-procedures alleen. Dit gebied moet regelmatig worden besproeid met een RNAse het verwijderen van product, zoals RNAse Away. De RNA monsters moet altijd worden behandeld met handschoenen en op ijs bewaard tot afb...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glycogeen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pelletpestels met microcentrifugebuis	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Fenol, Tris-verzadigd	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-vrije DNase-set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System voor RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026