Methoden voor de Studie van de zebravis bovenkaak Barbel

Samenvatting

De zebravis bovenkaak barbeel is een integumentary zintuig met ectodermale, mesodermale en de neurale lijst derivaten. Belangrijker nog is dat de volwassen barbeel regenereren na proximale amputatie. Deze video introduceert maxillaire barbeel ontwikkeling en demonstreert een chirurgische protocol voor regeneratie te induceren, gevolgd door de collectie, inbedding en stroomafwaarts beeldvorming van barbeel exemplaren.

Samenvatting

Barbelen zijn huid zintuiglijke aanhangsels gevonden in vissen, reptielen en amfibieën. De zebravis, Danio rerio, ontwikkelt twee paar barbels-een korte neus en een paar langere maxillaris paar. Barbeel weefsel bevat cellen van ectodermale, mesodermale en de neurale lijst oorsprong, waaronder de huid cellen, klieren, smaakpapillen, melanocyten, de bloedsomloop schepen en sensorische zenuwen. Tegenstelling tot de meeste volwassen weefsel, de bovenkaak barbeel is optisch helder, waardoor we aan de ontwikkeling en het onderhoud van deze types weefsel te visualiseren gedurende de hele levenscyclus.

Deze video toont vroege ontwikkeling van de bovenkaak barbeel (vanaf ongeveer een maand na de bevruchting) en toont een chirurgische protocol om regeneratie te induceren in de volwassen aanhangsel (> 3 maanden na de bevruchting). In het kort, is de linker maxillaire barbeel van een verdoofde vis verhoogd met steriele pincet net distaal van de caudale rand van de bovenkaak. Een fijne, steriele schaar de lente is gepositioneerd ten opzichte van de tang om de barbeel as cut op dit niveau, tot oprichting van een anatomische mijlpaal voor de amputatie vliegtuig. Regeneratieve groei kan worden gemeten ten opzichte van dit vlak, en in vergelijking met de contralaterale barbeel. Barbeel weefsel regenereert sneller, het bereiken van maximale hergroei binnen 2 weken na letsel.

Technieken voor het analyseren van de geregenereerde barbeel ook ontleden en inbedding matched pairs van barbels (regenereren en controle) in de putjes van een standaard DNA elektroforese gel. Ingebedde monsters zijn gunstig gefotografeerd onder een stereomicroscoop voor bruto morfologie en morfometrie, en kan worden opgeslagen voor weken voorafgaand aan de downstream-toepassingen zoals paraffine histologie, cryosectioning, en / of hele berg immunohistochemie. Deze methoden stellen de maxillaire barbeel als een roman in vivo tissue systeem voor het bestuderen van de regeneratieve capaciteit van meerdere celtypen in de genetische context van de zebravis.

Protocol

Zebravis veeteelt

Zebravis zijn ondergebracht en gefokt volgens standaard methoden ^1. Voorbij het einde van de larvale periode kan het ontwikkelingsstadium van een zebravis worden gemeten door de standaard lengte (SL), of de rechte lijn afstand in millimeter van het anteriormost punt van de bovenlip naar de basis van de staartvin (posteriormost hypural plaat) ^2. Op ongeveer een maand na de bevruchting (10-12 mm SL), de neus-en bovenkaak barbels verschijnen als transparant epitheel knoppen de buurt van de olfactorische pits en op de achterste hoeken van de maxillae, respectievelijk. Naarmate de zebravis rijpt, de barbelen te breiden naar smalle, snorhaar-achtige aanhangsels. Omdat de kaak barbeel is groter (2-3 mm) en gemakkelijker te manipuleren, ons protocol geldt alleen voor deze bijzondere aanhangsel; gelijksoortige technieken, kon echter worden aangepast aan de kleinere neus barbeel.

Barbel Clipping

1. Verdoof volwassen zebravissen op de gewenste fase (bv., 1.5-2.5 cm SL, ~ 3-6 maanden na de bevruchting) door onderdompeling in 0,015% MS-222 (ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat) gebufferd op pH 7,0 in het systeem water. Let op tot zwemmen bewegingen te stoppen en kieuwen ventilatie wordt traag en regelmatig. Afhankelijk van de grootte van de vis, complete narcose duurt ongeveer 2-5 minuten.
2. Met behulp van een aquarium visnet, transfer 1-3 vis op een tijd om een ​​opgevouwen stuk papier natte handdoek in een petrischaal. Met behulp van een stompe spatel, oriënteren de vissen, zodat ze parallel aan elkaar en linker laterale kant naar boven. Vouw een deel van de natte papieren handdoek over het caudale deel van de vis, die het gehele lichaam tot aan het operculum (kieuwdeksels) om de huid en kieuwen vochtig te houden tijdens de procedure.
3. Bekijk de Petri plaat onder de stereomicroscoop, met behulp van een lage-hoek invallende licht naar het hoofd gebied te verlichten. Focus op de onderkant van de linker maxillaire barbeel, die uitsteekt uit het achterste ventrale hoek van de bovenkaak (afb. 1).
   
   Figuur 1.
4. Strak pak de schacht van de barbeel iets distaal van de rand van de bovenkaak. Verhoog de barbeel as en steek de kaken van een fijne punt veer schaar net proximaal van de tang. De schaar kan worden aangeraakt om de tang voor stabiliteit. Schuif de bek van de schaar langs de schacht van de barbeel totdat de cutting edge benadert de rand van de bovenkaak. Sluit de schaar te snijden door de barbeel as. De geamputeerde barbeel, nog steeds greep in de tang, kan worden verwijderd voor fixatie of verdere observatie.
5. Onmiddellijk overdracht van de vis om een ​​kleine tank van het systeem schoon water (~ 500 ml) met daarin een druppel methyleenblauw aan oppervlakkige schimmelinfectie te controleren. Laat de vis om te herstellen 's nachts. De volgende ochtend, de terugkeer van de vis aan de opvoeding systeem. Barbeel regeneratie is maximaal na 2 weken.

Agar Inbedding van Matched Pairs Barbel

1. Verzamel vissen door middel van passende euthanasie techniek en vast te stellen in een 50 mL buis van 4% paraformaldehyde-fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met agitatie bij 4 ° C gedurende de nacht. Het fixeermiddel volume moet ten minste tien keer het volume van het weefsel te zijn. Na fixatie, gooi paraformaldehyde afval in een goedgekeurde container en spoel het weefsel in een aantal veranderingen van PBS.
2. Bereid in een 250 ml glazen fles 150 ml van 2% agarose (T _m ~ 37 ° C) in gedestilleerd water. Warmte met een magnetron of hete plaat, roeren periodiek totdat deze volledig opgelost. Equilibreren het gesmolten oplossing in een 50-60 ° C waterbad.
3. Monteer een standaard gelelektroforese rig door het plaatsen van een kleine pakking gel vorm (10 x 10 cm; ~ 100 ml gel volume) stevig tegen de zijkanten van de buffer kamer. Voeg 2-4 kleine getande sample kammen (4 x 1,5 mm).
4. Op een vlakke ondergrond, giet de gesmolten agarose in de mal om alleen betrekking hebben op de voet van de kammen, de vorming van zeer ondiepe putten. Onmiddellijk weer de overgebleven agarose in het warme water bad, dit zal later worden gebruikt om het weefsel (Steps 9-12) insluiten. Zet een lange glazen Pasteur pipet in de kolf aan de pipet houden aan de dezelfde temperatuur als de agarose.
5. Laat de gel uit te harden voor 20-30 minuten. Verwijder de kammen, verwijder vervolgens de gel mal met de geharde gel uit de buffer kamer. Stevig tape de open zijden van de gel vorm met laboratorium-tape, zodat de gel niet uitschuifbaar. Deze tape moet worden uitgebreid enkele millimeters over het oppervlak van de agar zodat extra agarose kunnen later worden toegevoegd (stap 13).
6. Plaats de gel vorm op het toneel van een stereomicroscoop. Magnify een lege goed en breng de randen in beeld.
7. Op het oppervlak van de agar grenzend aan het goed en pipetteer een druppel water of buffer met de vaste barbeel monsters (bv., regenereren en controle). Using gebogen insect pinnen, sleept u de vochtige specimens in de put en ze naar de bodem te duwen. Oriënteer de barbeel assen parallel aan elkaar en uitgelijnd met tegengestelde lange randen van de put. Oppervlaktespanning zal helpen houden het weefsel in stand.
8. Als u klaar bent om te verankeren, met een fijne pipet tip of de hoek van een laboratorium tissue om overtollig vocht te verwijderen uit de put. Werken snel, zodat er geen te laten het weefsel uitdrogen.
9. Met behulp van de verwarmde glazen Pasteur pipet voorzichtig pipet verse gesmolten agarose in en rond de monsters om de barbeel weefsel zegel op zijn plaats. Doe niet te veel. Voordat de agarose verhardt, maken last-minute aanpassingen met het insect pinnen.
10. Plaats een genummerde papieren exemplaar label naast de put en zet deze vast met een druppeltje agarose.
11. Herhaal stap 6 tot en met 10 voor elk putje van exemplaren.
12. Indien gewenst voor het imago van kalibratie, plaatst u een stuk papier met een bedrukt micrometer schaal (bijv. http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) in de bodem van een lege goed. Strijk het papier glad naar de bodem van de put en dek deze af met warm agarose.
13. Nadat alle exemplaren zijn ingebed, zal het oppervlak van de gel te onregelmatig, met geharde druppels agarose. Plaats de gel op een vlakke ondergrond en voorzichtig giet extra gesmolten agarose tot de bovenkant is uniform. Gebruik de kleinste hoeveelheid agarose nodig is om een ​​glad oppervlak te verkrijgen; teveel agarose zal uitgezonden licht fotografie onduidelijk. Laat deze toplaag te harden.
14. De gel kan nu worden gefotografeerd op het podium van een stereomicroscoop het bruto morfologie record voor elke barbeel paar. Image kalibratie wordt verkregen door het fotograferen van de embedded micrometer schaal.
15. De hele gel kan worden opgeslagen gewikkeld in natte papieren handdoekjes en verzegeld in een plastic zakje bij 4 ° gedurende enkele weken.
16. Voor verdere analyse kan agar blokken met matched pair van barbels worden gesneden uit de gel met een scalpel of scheermesje en verwerkt voor paraffine histologie of cryosectioning door standaard methoden ^3,4. Als alternatief kunnen individuele barbels worden ontleed uit de agarose met fijne naalden, gespoeld in water, en verwerkt voor andere downstream-toepassingen (bijvoorbeeld, hele-mount immunohistochemie of confocale microscopie).

Discussie

De zebravis bovenkaak barbeel is een onderbenut weefsel systeem voor het bestuderen van de groei, het onderhoud en regeneratie van verschillende celtypes in de zebravis. Hoewel de barbeel aanhangsel heeft geen menselijke analoge, worden de celtypen die het bevat zeer goed geconserveerd, waardoor het mogelijk is voor de huid, klieren, melanocyten, de bloedsomloop vaten en zenuwen in een optisch heldere en anatomisch eenvoudige cilindrische structuur te bestuderen. Net als bij de goed bestudeerde staartvin, kan barbeel weefsel geïnduceerd worden om zich te vernieuwen door amputatie. Met behulp van de rand van de bovenkaak als een anatomisch oriëntatiepunt, kan de amputatie vliegtuig precies geplaatst worden, het vergemakkelijken van de meting van de barbeel hergroei. Voor een ervaren operator, elke ingreep duurt slechts enkele seconden. Het herstel is snel, en we hebben tot nu toe ontdekt geen korte of lange termijn effecten op vissen gedrag. Zebravissen met een maxillaire barbeel zwemmen, eten en ras zo goed als niet-chirurgische controles, en hebben vergelijkbare overleven tot de tijd van weefsel verzamelen, tot 6 maanden na de operatie. De fysiologische effecten van deze operatie zal naar verwachting minimaal omdat 1) de extraorale smaakpapillen aan boord van de barbeel zijn ook te vinden op vele andere delen van de vis epitheel, met inbegrip van de lippen, wangen en hoofd ^5, en 2) differentiëren smaakpapillen op de regenererende barbeel binnen 72 uur (LeClair et al.., niet-gepubliceerde gegevens.) Hierdoor is de maxillaire barbeel een minimaal invasieve systeem voor het bestuderen van wondgenezing, revascularisatie, en reïnnervatie in het kader van een volwassen gewervelde dieren.

Na chirurgische inductie van regeneratie, kan barbels worden verzameld met intervallen voor morfometrische meting en / of microscopische analyse van vaste weefsel. Handig is dat de kaak barbeel is ongeveer de lengte (2-3 mm) en diameter (100-200 mm) van een zebravis embryo, het vergemakkelijken van de toepassing van de vele standaard protocollen, zoals paraffine histologie, cryosectioning, hele-mount immunohistochemie, en in situ hybridisatie. Tezamen bieden deze kenmerken maken de maxillaire barbeel een zeer haalbaar in vivo model voor het bestuderen van weefselherstel en regeneratie.

Materialen

Microscoop Equipment

Een stereo ontleden microscoop met doorvallend en incidenten glasvezel-verlichting is nodig voor barbeel knippen en agar inbedding.

Barbel Clipping

• Vis-systeem water
• 2 zebravis kruising tanks
• MS-222 (ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat; Sigma Chemical # E10521-10G)
• steriele 120-mm Petri plaat
• natte papieren handdoeken
• stompe metalen spatel
• Dumont # 55 Bio Inox pincet (Fine Science Tools # 11255-20)
• Mini-Vannas veer schaar (Fine Science Tools # 15000-00)
• methyleenblauw antischimmelmiddel (Drs. Foster & Smith # CD-905781)
• kleine aquarium visnet

Tissue verzamelen en agar inbedding

• 4% paraformaldehyde in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PF-PBS), in hoeveelheden verdeeld in 50 ml conische buizen en bevroren opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik
• 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,27 tot 6)
• 250 ml glazen kolf
• 2% agarose in gedistilleerd water
• standaard kleine agarosegelelektroforese rig (gel size = ~ 10 cm vierkant)
• kleine getande elektroforese sample kam (comb afmeting 4 x 1,5 mm)
• warm water bad (50-60 ° C)
• laboratorium tape
• zwart emaille insect pinnen, afmeting 000 (Fine Science Tools # 26.000-25)
• 1-2 pin houders (Fine Science tools # 26.016-12)
• 9-inch glas Pasteur pipet
• pipet gloeilamp of pomp
• laboratorium weefsel
• kleine papieren etiketten
• (Optioneel) afgedrukt calibratie schaal
• natte papieren handdoeken
• zip-sluiting plastic zak
• scalpel / scheermesje (uit te snijden agar blokken)