In deze video-artikel stellen we een methode voor de isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen met behulp van een snelle magnetische kraal bijgestaan celsortering strategie. RNA verkregen uit de geïsoleerde cellen kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals microarray-analyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren
In dit artikel
Samenvatting
Protocol
Algemeen Reacties op Magnetic Bead sorteren van Drosophila perifere neuronen (Totaal Timing voor de voltooiing van het protocol: 2,5-3 uur)
Standaard lab procedures voor het handhaven van een schone, RNAse vrije omgeving moeten worden nageleefd te allen tijde RNA degradatie te voorkomen.
Wanneer de Drosophila larven cuticula is ontleed en geplaatst in de cel dissociatie buffer, de perifere neuronen zijn een van de laatste cellen los te maken van de cuticula. We hebben benut deze eigenschap en ontworpen dit protocol voor de meeste van de niet-specifieke cellen van de cuticula, zoals spier-en v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol hier gepresenteerde is geoptimaliseerd voor de isolatie en zuivering van de perifere neuronen die strak te houden aan de binnenkant van de Drosophila derde instar larven nagelriemen met behulp van een magnetisch bolletje celsortering strategie. Hoewel we hebben gebruikt dit protocol om specifiek Drosophila da neuronen, toepassingen van dit protocol te isoleren om het isolement van andere celtypen die voldoen aan de cuticula in larve-of popstadium stadia van ontwikkeling (bijvoorbeeld epitheel, spieren, ande.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Wij danken Drs. Yuh-Nung Jan en Wes Grueber voor het aanbieden van vliegen voorraden die in deze studie. De auteurs erkennen de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust voor de ondersteuning van dit onderzoek (DNC) en de George Mason University Provost's Office (EPRI).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
Uitrusting
- (10) Neodymium magneten blok (K & J Magnetics, Inc, Cat. # B444B), als alternatief DynaMag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) kan worden gebruikt.
- Kontes glasvlies Grinder, 2 ml van de arbeidsgeschiktheid, met een grote ruimte pestle (Cat. # 885.300 tot 0,002)
- Cel filters, bijvoorbeeld MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407)
- 35 mm petri-schalen bekleed met Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358 tot 1004)
- Ontleden tools: twee paren van Dumont nr. 5 pincet (Fine Science Tools, Cat # 11251-20).
- Vannas lente micro-dissectie schaar (Fine Science Tools, Cat. # 15000-08)
- Pipetten (P-1000, P-100, P-10) met disposable tips
- Standaard hemocytometer naar de cellen en een schatting zuiverheid tellen
- Pasteurpipetten met vuur gepolijste uiteinden van de standaard diameter, gedaald tot ~ 50% van de standaard diameter en versmald tot ~ 25% van de standaard diameter voor tritureren
- Tafelblad micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Draaikolk
- TL-stereo-microscoop (een Leica MZ16FA werd gebruikt in dit protocol)
Referenties
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
