Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Samenvatting

Een stamcel is gedefinieerd als een cel met de capaciteit om zowel de zelf-vernieuwing en het genereren van meerdere gedifferentieerde nageslacht. Embryonale stamcellen (ESC) zijn afgeleid van de blastocyst van de vroege embryo en zijn pluripotent in differentiative vermogen. Hun ruime differentiative potentieel heeft hen de focus van veel onderzoek gericht op het afleiden hoe ze te coax te klinisch bruikbare soorten cellen te genereren. De succesvolle afleiding van hematopoietische stamcellen (HSC) van muis ESC is onlangs bereikt en kunnen worden gevisualiseerd in deze video protocol. HSC, misschien wel de klinisch meest uitgebuite cel populatie, worden gebruikt om een ​​groot aantal hematopoietische maligniteiten en aandoeningen te behandelen. Echter, veel patiënten die baat kan hebben bij HSC therapie geen toegang tot geschikte donoren. ESC zou kunnen bieden een alternatieve bron van HSC voor deze patiënten. Het volgende protocol voorziet in een basislijn vanwaar ESC-HSC kan worden bestudeerd en op de hoogte inspanningen om HSC isoleren van menselijke ESC. In dit protocol worden ESC gedifferentieerd embryoid instanties (EBS) voor 6 dagen in de handel verkrijgbare serum vooraf gescreend voor een optimale hematopoietische differentiatie. EBS worden vervolgens gescheiden en geïnfecteerd met retrovirale HoxB4. Geïnfecteerde EB-afgeleide cellen worden uitgeplaat op OP9 stroma, een beenmerg stromale cellijn afgeleid van de Calvaria van M-CSF-/ - muizen, en co-gekweekt in de aanwezigheid van hematopoiese het bevorderen van cytokines voor tien dagen. Tijdens deze co-cultuur, de geïnfecteerde cellen sterk uit te breiden, wat resulteert in de generatie van een heterogene pool van 100s van miljoenen cellen. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt om de reddings-en reconstitueren dodelijk bestraalde muizen.

Protocol

Differentiatie van embryonale stamcellen

1. Verzamel een bijna samenvloeiing fles van embryonale stamcellen (ESC) via een behandeling met trypsine ESC.
2. Resuspendeer cellen in 5 ml Differentiatie media en over te dragen aan een niet-gelatine gecoate T25. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Ophalen supernatant en het verzamelen van cellen via centrifugeren.
   
   Let op: muis embryonale fibroblasten (MEF) van het ESC culturen hechten gemakkelijk aan de niet-gelatine gecoate T25 en dus zijn uitgeput van de cultuur tijdens deze plating stap. Als je niet kweken uw ESC op MEFs, gaat u naar de pre-plaat.
   
   
3. Resuspen....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficiënte muizen	Dier	Taconic Farm
Plateschudder	Instrument	VWR international	33998-360	Orbital Shaker van Ikaworks
Multikanalspipette	Instrument	VWR international	15000-174	ePet van BioHit
ES trypsine	Reagens	Invitrogen	15090-046	0,25% trypsine in PBS
Standaard trypsine	Reagens	Invitrogen	25300-062	0,05% trypsine-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzymevrije dissociatiebuffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociatie-enzymmix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg collagenase IV
Hyaluronidase	Reagens	Sigma-Aldrich	H2126	invriezen in aliquots van 500 μL en herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden.
DNAse	Reagens	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protaminesulfaat	Reagens	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB-differentiatiemedium	medium			Raadpleeg het recept in het bijgevoegde Protocol.doc
10% IMDM	medium			Raadpleeg het recept in het bijgevoegde Protocol.doc
10% IMDM+cytokinen	medium			Raadpleeg het recept in het bijgevoegde Protocol.doc
20% anti-MEM				Raadpleeg het recept in het bijgevoegde Protocol.doc