$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Constructie van expressievector en expressie:
De pSESAME-Cre expressie vector werd geconstrueerd door het invoegen van een Cre-codering fragment in pSESAME via AvrII en Nhel restrictie sites met behulp van standaard-klonen methoden. pSESAME codeert voor een fusie-eiwit dat bestaat uit een histidine-tag, TAT-domein, NLS volgorde en Cre, afgekort HTNCre. Voor expressie van HTNCre de pSESAME-Cre werd getransformeerd in TUNER (DE3) pLacI en gebruikt om een glycerol voorraad te bereiden.
- Een over-night cultuur werd geënt met behulp van een pipet tip bekleed met veranderde bacteriën uit de glycerol voorraad. De over-avond cultuur bestond uit LB media aangevuld met 0,5% glucose [v / v] en carbenicilline bij een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml en mocht om te groeien bij 37 ° C gedurende 16 uur.
- De volgende dag de dichtbevolkte gegroeid nacht cultuur werd gebruikt om de uitdrukking cultuur inoculeren in een verhouding van 1 tot 40 en werd in een incubator bij 37 ° C. Expressie cultuur bestond uit TB media aangevuld met 0,5% glucose [v / v] en ampicilline bij een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml.
- Bij een OD 595 van 1,5 de uitdrukking cultuur werd geïnduceerd met 0,5 mM IPTG gedurende 1 uur
- Vervolgens bacteriën werden verzameld door centrifugeren bij 5000 rpm gedurende 10 minuten in een SLA3000 rotor.
- Bacteriën pellets werden opgeslagen bij min 20 ° C tot zuivering.
Zuivering van cel-permeabele eiwit:
- Bevroren bacteriën pellets werden geresuspendeerd in 10 ml lysis buffer per liter fles cultuur gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Suspensie werd vervolgens geïncubeerd met 1 mg / ml lysozym voor nog eens 15 minuten tijdens het mengen bij kamertemperatuur.
- 25 U / mL benzonase is later toegevoegd en geïncubeerd tijdens het mengen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Na sonificatie op ijs 1,5 min met 0,5 s pulsen bij 45% van het vermogen, 1 ml koud wijnsteenzuur zout buffer (TSB) per ml suspensie werd zorgvuldig toegevoegd tijdens het mengen en geïncubeerd gedurende 5 minuten op ijs. SDS-PAGE steekproef van lysaat fractie (L) werd genomen.
- Gewist lysaat werd verkregen door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 30 min bij 30000 g. SDS-PAGE monsters van oplosbare (S) en de onoplosbare fracties (I) werden genomen.
- Het supernatant werd overgebracht in de frisse 50 ml Falcon buizen en werd vervolgens voorzichtig gemengd gedurende 1 uur bij 4 ° C met 2 ml van 50% Ni-NTA slurry per liter van de initiële expressie cultuur.
- De suspensie werd verpakt in een zwaartekracht EconoPac kolom (SDS-PAGE sample van flow-through fractie (FT) werd genomen) en tweemaal gewassen met 5 bed-volumes van wasbuffer. SDS-PAGE monsters van zowel het wassen van fracties (W1 en W2) werden verzameld.
- HTNCre-bevattende fracties werden geëlueerd met drie bed-volumes van elutie buffer en steekproef van eluaat fractie (E) voor SDS-PAGE-analyse werd genomen.
- Imidazool werd verwijderd door dialyseren elutie fractie tegen hoge zout-buffer tweemaal.
- Het eiwit-oplossing werd verder geconcentreerd door dialyseren tegen glycerol buffer tweemaal. In alle dialyse stappen de verhouding van de buffer om te proeven was op zijn minst 50. Deze procedure resulteerde in een glycerol voorraad oplossing die HTNCre op een normale concentratie tussen 200 en 450 uM, dwz 1 liter van meningsuiting cultuur resulteren in ~ 12 mg eiwit. Voorbeeld van glycerol voorraad (GS) voor SDS-PAGE-analyse werd verzameld. HTNCre voorraad oplossing kan worden bewaard bij min 20 ° C.
Figuur 1: SDS-PAGE-analyse van de monsters verzameld tijdens het zuiveringsproces van het Cre recombinase. Inductie van Cre expressie wordt aangegeven door dominante band in lysaat fractie. Hoewel een deel van het eiwit is onoplosbaar het Cre eiwit kan verder worden verrijkt zoals te zien in eluaat en glycerol voorraad fracties. L: Lysate, I: Niet oplosbaar, S: Supernatant, FT: Flow-through, W: Wassen, E: eluaat GS: Gylcerol Stock. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Proteïne transductie in muriene embryonale stamcellen (ES)-cellen:
- ES-cellen die een voorwaardelijke β-galactosidase reporter 5 construct werden gezaaid als enkele cellen met behulp van TrypLE ™ Express voor dissociatie van hechtende cellen. Na 4 tot 6 uur de cellen opnieuw had aangesloten en het medium werd verwijderd.
- Vervolgens ES-cellen werden geïncubeerd met HTNCre-bevattend medium voor 16 uur.
- Een gepaste hoeveelheid HTNCre eiwit (overeenkomend met 10 uM) uit de glycerol voorraad werd verdund in ES medium en vervolgens steriel gefiltreerd (0,22 pm).
- Na het proteïne transductie medium werd veranderd terug naar de normale groei medium.
- Na twee dagen werden de cellen gewassen met PBS en gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten.
- Twee extrationale wasstappen met PBS werden uitgevoerd voor de X-Gal kleuring werd uitgevoerd.
- Vaste cellen werden bedekt met een laag van X-Gal kleuroplossing 6 en geïncubeerd gedurende de nacht bij 37 ° C.
Representatieve resultaten:
De volgende dag X-Gal kleuroplossing werd streefde en de cellen werden bedekt met een laag van PBS voor microscopie analyse. 80 tot 100% van de gerecombineerde cellen kon worden waargenomen binnen de muriene embryonale stamcellen beoordeeld door β-galactosidase-activiteit.
