Method Article

Het meten van diffusiecoëfficiënten via twee-foton Fluorescence Recovery After Photobleaching

DOI:

10.3791/1636

⸱

February 26th, 2010

 , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Rochester, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel beschrijven we de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiënten het gebruik van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken. We zullen beginnen met het uitlijnen van de laser langs de optische pad naar het monster en het bepalen van de juiste experimentele parameters, ga dan verder het genereren en tenslotte montage fluorescentie herstel curves.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi-fluorescentie herstel na fotobleken is een microscopie techniek die gebruikt wordt om de diffusiecoëfficiënt (of analoge transport parameters) van macromoleculen te meten, en kan worden toegepast op zowel

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lijn de optiek.

De sleutel apparatuur voor een MP-FRAP experiment zijn onder meer: ​​een mode-locked laserbron, Pockels Cell (voor beam modulatie), puls generator, dichroïsche, objectief, fluorescentie-emissie filter, gated fotomultiplicatorbuis, en een data-opname-systeem (foton tegen te gaan en multichannel scaler).

2. Vast te stellen veilig te controleren bevoegdheden.

  1. Het verkleinen van de laser op een lage, maar redelijke, macht voor het genereren van fluorescentie in het monster.
  2. Focus binnen de steekproef.
  3. Stel een foton tegen integreren over een tijdschaal veel langer da....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kracht van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken ligt in zijn vermogen om dikke stalen sonde met 3D-resolutie. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1990, heeft MP-FRAP is gebruikt om de diffusiecoëfficiënt (of analoge transport parameters) te bepalen in cellichamen, ex vivo dikke plakken weefsel, en in vivo weefsel en interstitium. In dit artikel presenteerden wij de apparatuur die nodig is om een ​​MP-FRAP experiment, evenals de juiste procedure voor het uitlijnen van de stralengang run, waa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Defensie Era of Hope Scholar Award (No. W81XWH-05-0396) en een Pew Scholar in de Biomedische Wetenschappen Award uit aan Edward B. Brown III.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ti:sapphire laserNewport Corp.Mai Tai
Pockels CellConoptics350-80
Laser Scanning MicroscopeOlympus CorporationFluoview
Short pass dichroic mirrorChroma Technology Corp.670 DCSX-2P
Photomultiplier tubeHamamatsu Corp.HC125-02
Photon counterStanford Research SystemsSR 400
Multi-channel scaler/averagerStanford Research SystemsSR 430
Pulse GeneratorStanford Research SystemsDG 535
FITC-BSAInvitrogen--

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
  2. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two photon Fluorescence RecoveryFluorescence Recovery After PhotobleachingDiffusion Coefficient MeasurementLaser Beam AlignmentPockels Cell ModulationPhoton Counting AnalysisLabVIEW AutomationMATLAB Curve FittingAqueous Fluorescent DyeFluorescence Recovery Curve

Related Articles