Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch co-cultuur model voor gelijktijdige en gelokaliseerde cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Dit model kan gebruikt worden voor het onderzoeken van de rol van verschillende oplosbare moleculaire signalen op pathogenese en het scherm van de effectiviteit van de vermeende probiotische bacteriestammen.

Samenvatting

De menselijke gastro-intestinale (GI) stelsel is een unieke omgeving waarin darmepitheelcellen en niet-pathogene (commensale) bacteriën naast elkaar bestaan. Men heeft voorgesteld dat de micro-omgeving die de pathogeen ontmoetingen in de commensale laag is van belang bij het bepalen van de mate van kolonisatie. Huidige cultuur methoden voor onderzoek pathogeen kolonisatie zijn niet goed geschikt voor het onderzoeken van deze hypothese omdat zij co-cultuur van bacteriën en epitheelcellen niet in staat stellen op een wijze die het maag-darmkanaal micro-omgeving nabootst. Hier beschrijven we een microfluïdisch co-cultuur model dat onafhankelijke cultuur van eukaryote cellen en bacteriën mogelijk maakt, en het testen van het effect van de commensale micro-omgeving op de ziekteverwekker kolonisatie. De co-cultuur model wordt aangetoond door het ontwikkelen van een commensale

Protocol

1. Fabricage van silicium meesters met behulp van standaard SU-8 fotolithografie ^een (niet getoond in deze video).

1. Gebruik standaard SU-8 fotolithografie methoden om een ​​SU-8 "masters" (SU-8 2050, Microchem, Newton, MA) voor het fabriceren van de verschillende componenten (PDMS membranen van verschillende dikte, co-cultuur kamer) in een cleanroom. Creëren Deze master-mallen kunnen worden vervaardigd op een microfabricage faciliteit (bijv. Stanford Microfluidics Foundry; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. Voorafgaand aan PDMS replicatie, bloot de SU-8 masters te fluorosilane damp in een exsiccator verbonden aan een vacuüm bron om gemakkelijk los van het PDMS te vergemakkelijken van de meester. Voeg een druppel fluorosilane op een papieren handdoek en vacuüm voor een min van toepassing zijn. Verwijder het vacuüm en laat 30 min voor de depositie van fluorosilane. Houd de SU-8 meester in een gesloten container voor toekomstig gebruik.

2. Replica gieten van PDMS van de SU-8 meester ²

1. De vloeibare laag en de controle laag zijn gemaakt door replica gieten van PDMS van de SU-8 master.
2. Meng de PDMS pre-polymeer en cross-linker op een 10:01 gew. verhouding en ontgassen in een exsiccator voor een uur (of tot de luchtbellen zijn verwijderd uit het PDMS mengsel).
3. Plaats de SU-8 meester in een petrischaal en zorgvuldig de PDMS mengsel giet op de top van de SU-8 master. Ontgas de PDMS opnieuw.
4. Spin de mal bij 1200 rpm gedurende een minuut om een ​​uniform PDMS dikte van ongeveer 100 urn krijgen op de mal.
5. Verhit de petrischaal met de PDMS en de SU-8 meester schimmel bij 80 ° C gedurende een uur aan het PDMS genezen.
6. Verwijder de uitgeharde PDMS bedekte SU-8 meester van de kookplaat.
7. Schil de PDMS mal van de SU-8 master.
8. Boor vier gaten in het PDMS mal met behulp van een 20 gauge stompe naald-end voor twee bacteriën inhammen, een stopcontact en een pneumatische poort.

3. Verlijmen van Multilayer PDMS-apparaten: Dit apparaat is gemonteerd met drie lagen: een toplaag die het belangrijkste kanaal, een middelste pneumatische laag, en een onderste bacteriële laag die de kanalen voor bacteriën bevat. De drie lagen worden gemonteerd, zoals hieronder beschreven.

1. Wet van de PDMS membranen met methanol en zorgvuldig verwijderen hen van hun SU-8 meester mal met een schone pincet. Plaats membraan op een teflon vel.
2. Plaats de pneumatische membraan en de vloeibare laag op een zuurstof plasma kamer. Zet plasma gedurende 40 sec (zuurstofdruk 10 sccm, RF power 100W).
3. Na blootstelling aan plasma, uit te lijnen (binnen 10 minuten) het membraan aan de onderkant PDMS kanaal met behulp van een tang. Het toevoegen van methanol op het membraan en het PDMS lagen helpt het vrije verkeer van de lagen, en maakt afstemming gemakkelijker. In dit geval wordt het apparaat op een stukje gaas om de methanol dampen te ontsnappen.
4. Cure de uitgelijnde PDMS lagen op een kookplaat bij 80 ° C gedurende 8 uur
5. Na het verlijmen van de pneumatische membraan op de onderste laag, herhaalt u de stappen 3,2 tot 3,4 voor het verlijmen van de top-kanaal op de verzamelde samengestelde PDMS-apparaat.

4. Montage van de PDMS-apparaat ^3,4

1. Boor gaten in de inlaat en uitlaat poorten die worden gebruikt voor het zaaien eukaryote cellen en bacteriën.
2. Sluit Tygon slang (0,01 inch OD) naar de havens en bedienen van de pneumatische laag door te trekken met een 20 ml spuit.
3. Plaats de PDMS-model en een pre-gereinigde glazen glijden in een zuurstof plasma kamer. Zet plasma voor 20 seconden (zuurstofdruk 20 sccm, RF power 300W) zonder toepassing van het vacuüm.
4. Om contact tussen het eiland muur (PDMS) binding aan het glas schuiven te voorkomen, direct verbinding een injectiespuit met het apparaat en toe te passen vacuüm door te trekken van de spuit en hield het op zijn plaats.
5. Druk de PDMS-model op het glas (binnen 2 minuten).
6. Cure de PDMS-apparaat bij 80 ° C gedurende 10 minuten.

5. Het behandelen van het glasoppervlak met fibronectine

1. Steriliseer het apparaat onder UV gedurende 15 minuten na het aansluiten van Tygon slang aan elke poort.
2. Vullen en de stroom van de gesteriliseerde PBS in het kanaal om eventueel vuil te verwijderen in het kanaal. Solliciteer stroom gedurende 10 minuten om luchtbellen te verwijderen. De luchtbellen kan gemakkelijk ontsnappen aan de PDMS omwille van zijn gas doorlaatbaarheid.
3. Vul een kleurstof oplossing in de luchtleiding om de vorming van luchtbellen in het kanaal te voorkomen.
4. Ter bevordering van eukaryote cel zaaien op het glas, invoering van een 1 ug / ml-oplossing van fibronectine in het apparaat en incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ° C.
5. Was het teveel aan fibronectine met 1 ml van de groei media.

6. Vorming en meting van commensale E. coli biofilm ineilanden

1. Verdun de commensale bacteriën (bijvoorbeeld E. coli BW25113/pCM18) in M9 minimale media OD ₆₀₀ ~ 1 voor het vormen van een commensale biofilm in de gesloten kamers / eilanden.
2. Sluit het eiland muur door het toepassen van positieve vloeistofdruk. Een zelfgemaakte air-to-liquid druk converter wordt gebruikt om de vorming van luchtbellen in het kanaal te voorkomen.
3. Introduceer de commensale E. coli in de eilanden met de klep dicht, en laat bacteriën gedurende 1 uur hechten bij 32 ° C.
4. Was de losse bacteriën en perfuseren een verdunde bacteriële suspensie (OD ₆₀₀ ~ 0.05) op 0.25mL/hr gedurende 12 uur.
5. Spoel de biofilm met vers DMEM groei media losjes verbonden bacteriën te verwijderen en voor de eukaryote cel bevestiging voor te bereiden.
6. Het imago van de biofilm met een Leica TCS SP5 confocale laser scanning microscoop (Bannockburn, IL), en visualiseer de biofilm architectuur van het gebruik van de IMARIS software ^5.

7. Zaaien eukaryote cellen rond bacteriële eilanden ^6-8

1. Trypsinize HeLa cellen van weefselkweek kolf en resuspendeer in DMEM media voor een zaaien dichtheid van 5 x 10 ⁵ cellen / ml.
2. Introduceer HeLa cellen in het apparaat op een debiet van 2 ml / min met behulp van een Picoplus injectiepomp (Harvard Apparattus, MA). Zorg ervoor dat het eiland muur is verlaagd zodat de bacteriële biofilm staat los van de HeLa cel regio. Deze stap moet worden uitgevoerd op het podium van een lichtmicroscoop, zodat de uniformiteit van zaaien kan worden bepaald.
3. Klem de cel stopcontact om de beweging van de celsuspensie te verminderen in het kanaal en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C in een 5% CO ₂ incubator.
4. Perfuseren het apparaat met groeimedium bij 0,5 ml / uur tot losse cellen te verwijderen.
5. Vernieuw de DMEM media voor HeLa en commensale E. coli elke 6 uur.

8. Introductie van pathogene bacteriën in het eiland en de blootstelling aan eukaryote cellen

1. Bereid E. coli O157: H7 (EHEC) om HeLa cellen te infecteren bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 100:1 200:1 (aantal EHEC per HeLa cel).
2. Afspoelen en wassen losjes verbonden commensale bacteriën.
3. Introduceer een verdunde EHEC suspensie (OD ₆₀₀ ~ 0.1) in de eilanden.
4. Incubeer het apparaat bij 37 ° C in een 5% CO ₂ incubator gedurende 6 uur zonder stroom te laten EHEC te worden blootgesteld aan signalen aanwezig zijn in de commensale biofilm.
5. Til de PDMS muur om EHEC bloot in de commensale eilanden HeLa cellen voor 6 uur.
6. Spoel het kanaal met PBS en vlekken voor de levende en dode cellen met behulp van de Live / Dead kit (L3224, Invitrogen, CA).
7. Afbeelding meerdere locaties op een Zeiss Axiovert 200M fluorescentie microscoop en een schatting van het aantal levende en dode cellen.

9. Vertegenwoordiger Resultaten ⁹

De volgorde van de gebeurtenissen in het maagdarmkanaal infecties werd nagebootst door het ontwikkelen van een monolaag van HeLa cellen en een commensale E. coli biofilm en het blootstellen van EHEC op de commensale biofilm voorafgaand aan de infectie van HeLa-cellen. De stappen die betrokken zijn bij de fabricage van de microfluïdische co-cultuur model zijn weergegeven in figuur 1. Figuur 2A toont een 3-dimensionale weergave van de co-cultuur-apparaat. De twee regio's in de co-cultuur het apparaat van de eukaryote cel cultuur kamer en de bacteriële eiland zijn weergegeven in figuur 2B met verschillende kleuren kleurstoffen (paars voor de eukaryotische regio's en groen voor de bacteriële eiland). De haalbaarheid van het isoleren van de bacteriecultuur regio's uit de omliggende eukaryotische regio is weergegeven in figuur 2C gebruik van kleurstoffen. Figuur 3 laat representatieve resultaten van co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Figuur 3A toont kolonisatie van de commensale biofilm (groen) eiland EHEC (rood). Figuur 3B toont het naast elkaar plaatsen van epitheliale cellen en commensale E. coli met EHEC in de bacteriële eiland. De RFP uitdrukken EHEC en GFP uitdrukken commensale bacteriën zijn gelokaliseerd op het eiland toen het PDMS wand wordt verlaagd, ter illustratie van de haalbaarheid van het isoleren van de bacteriële eiland van epitheelcellen.

Figuur 1: Mobiele zaaien regeling in de co-cultuur model. (1) De PDMS muur is verlaagd naar een eiland vormen, zijn commensale bacteriën geïntroduceerd in het eiland, en fibronectine is gestroomd rond het eiland. (2) HeLa cellen gezaaid in de regio's rond het eiland. (3) Na HeLa cellen samenvloeiing te bereiken en de commensale biofilm heeft ontwikkeld, wordt EHEC geïntroduceerd in het eiland. (4) De PDMS wand wordt opgeheventot HeLa cellen rond het eiland te EHEC bloot te leggen. Inzet toont details van de klep bediening.

Figuur 2: Microfluïdische model voor co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. (A) Drie-dimensionale weergave van de co-cultuur apparaat met pneumatisch aangedreven trapping regio's voor het vormen van bacteriële eilanden onder de epitheelcellen. Elke bacteriële eiland (1200 pm diameter en 1000 um uit elkaar) heeft een aparte inlaat en uitlaat voor het verstrekken van groei media en het verwijderen van afval van het eiland. (B) microfoto van de co-cultuur apparaat met kleurstoffen met de verschillende regio's (epitheelcellen zone, bacteriële eilanden). (C) De trouw van de pneumatische opvangsysteem wordt aangetoond door het verlagen van de PDMS muur (linker paneel) met behulp van een pneumatisch-geactiveerde kanaal (blauw), de invoering van paars kleurstof in de gesloten eiland eilanden, en vloeiende gele kleurstof om het voor 48 uur Wanneer de PDMS muur is (rechter paneel) verhoogd, is het eiland regio blootgesteld aan de omliggende gele kleurstof. Schaalbalk staat voor 500 pm.

Figuur 3: Co-cultuur van HeLa cellen en bacteriën. (A) Fluorescentie beeld van RFP-expressie EHEC en GFP expressie E. coli in BW25113 eiland. (B) Overlay van de verzonden, groene en rode fluorescentie beelden in het apparaat. Schaalbalk staat voor 200 pm.

Discussie

Conventionele testen voor pathogeen bevestiging en kolonisatie gebruik maken van een monolaag van eukaryote cellen in weefselculturen platen waarin ziekteverwekkers worden toegevoegd. Deze modellen zijn fysiologisch niet relevant zijn als ze niet een commensale bacteriële biofilm ontwikkeld op eukaryote cellen te nemen. Eenvoudige toevoeging van een pre-volwassen bacteriecultuur aan eukaryote cellen is onwaarschijnlijk dat leiden tot deze bevestiging als biofilms zijn zeer georganiseerde structuren die zich ontwikkelen ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SU-8 2050	MicroChem Corp.
hoogresolutie (16.256 dpi) fotolithografiemasker	Fineline-Imaging Inc, CO
Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silaan	Sigma-Aldrich	77279
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5KG
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30002.02
Programmeerbare spincoater	Laurell Tech Corp	WS0650S
Mask aligner	Neurotronix	Q4000
Zuurstofplasma-etser	March Plasma System, CA	CS-1701
Spuitpomp	Harvard Apparatus
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L-3224