De auteurs hebben niets te melden.

christopher hughes: een in vitro model voor de studie van angiogenese (interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher CW Hughes beschrijft het nut van zijn cultuur systeem voor het bestuderen van angiogenese in vitro. Hij legt het belang van de fibroblasten dat een kritische, nog niet geïdentificeerde, oplosbare factor die het mogelijk maken endotheelcellen aan schepen in de cultuur vorm die tak, de juiste vorm lumen, en ondergaan anastomose afscheiden.

Christopher Hughes: Een in vitro model voor de Studie van angiogenese (Interview)

Christopher C.W. Hughes beschrijft het nut van zijn culturesysteem voor het bestuderen van angiogenese in vitro. Hij legt de belangrijkheid uit van fibroblasten die ...

Hoi, mijn naam is Dr. Christopher Hughes. Ik ben professor aan de University of California Irvine en mijn lab doet onderzoek naar angiogenese. We zijn in het bijzonder geïnteresseerd in de genen die het proces van angiogenese reguleren.Wij hebben in vitro assays geoptimaliseerd op basis van het werk van Nelson et al., en met deze assay kunnen we alle verschillende processen bestuderen die plaatsvinden tijdens angiogenese. We coaten Tedex-beads, kleine kraaltjes, met endotheelcellen. Vervolgens bedden we deze in fibrinegels en voegen we groeifactoren toe.En gedurende meerdere dagen groeien de endotheelcellen uit de kralen. Ze migreren, richten zich uit, prolifereren, vormen buisjes, vertakken en vormen anastomosen. Hierdoor hebben we na ongeveer 10 dagen een volledig capillair-achtig netwerk in cultuur.Nou, sommige van de problemen met in vivo angiogenese-assays, bijvoorbeeld die in muizen worden uitgevoerd, is dat het niet erg gemakkelijk is om het systeem te manipuleren. Het is lastig om te visualiseren wat er in een dier gebeurt; je kunt de angiogenese niet echt zien plaatsvinden. En als je het systeem wilt manipuleren in onze in vitro culturen, is het heel eenvoudig om de endotheliale cellen genetisch te manipuleren, genen aan of uit te zetten en naar de effecten daarvan op de uitlopende angiogenese te kijken.En dat is veel moeilijker te doen in het hele dier. Je moet knock-outs of knock-ins maken. Dat zijn dus de twee belangrijkste voordelen.Het is gemakkelijk te manipuleren en eenvoudig te visualiseren. In de loop der jaren zijn er daarom verschillende in vitro angiogenese-assays ontwikkeld, die elk hun eigen voor- en nadelen hebben. Een bijzonder bekende methode is de matrix-gel-assay, waarbij endotheelcellen op een extracellulaire matrix genaamd matrigel worden geplaatst.En het probleem daar is dat de endotheelcellen koordachtige structuren vormen, maar ze vormen nooit echt goede gelumineerde vaten. Men ziet geen uitlopers en geen anastomose. Er zijn collageengelmodellen die nuttig kunnen zijn.Er zijn er veel van die gevallen waarin men geen proliferatie van de endotheelcellen ziet. Men ziet doorgaans geen anastomose. De fibrinagel-assay die wij hebben ontwikkeld is gebaseerd op een model van Nelson Kar, gepubliceerd in het midden van de jaren negentig.En we hebben dat nu drastisch verbeterd, zodat we alle stadia van angiogenese kunnen waarnemen. We kunnen het initiële uitloping en de migratie volgen. We zien celproliferatie, lumenvorming, vertakking en uiteindelijk anastomose om een volledig vasculair netwerk in vitro te vormen.Daarom geloven wij dat deze assay werkelijk het beste in vitro-systeem is om al die verschillende stadia van angiogenese te bestuderen. Een ander voordeel van deze in vitro-assay is dat we laser-capture microdissectie kunnen toepassen; we kunnen de cultuur centrifugeren zodat deze zeer vlak wordt, en vervolgens de laser-capture microdissectiemicroscoop gebruiken. We kunnen zo individuele cellen isoleren, waarbij we in het bijzonder geïnteresseerd zijn in de tipcellen.Vervolgens snijden we deze uit, zodat we de genexpressie kunnen bestuderen, in het bijzonder in de tipcellen versus de trunkcellen, de cellen die daadwerkelijk het lumen vormen. Onze hypothese is dat er een differentiële genexpressie zal zijn tussen deze twee celpopulaties. We kunnen dit onderzoeken; in een in vivo systeem zou dat vrijwel onmogelijk zijn.We zijn daarom van mening dat dit een ander groot voordeel is van het gebruik van deze in vitro assay. In het vroege werk dat hieraan is gedaan, zoals ik al noemde door Nelson Recon, werden microvasculaire endotheelcellen gebruikt. Er is veel overtuiging dat microvasculaire endotheelcellen de cellen zijn die je voor een assay als deze zou willen gebruiken, omdat in vivo juist de microvasculaire EC's zijn die daadwerkelijk nieuwe vaten vormen.We hebben besloten dit te proberen met ve. Dit zijn menselijke endotheelcellen uit de navelstrengader, om een aantal redenen. Een daarvan is dat deze cellen zeer gemakkelijk verkrijgbaar zijn.U kunt naar het ziekenhuis gaan, navelstrengen verkrijgen uit de verloskamers en de cellen zeer eenvoudig isoleren. Daarnaast worden deze cellen al vele jaren in culturen gebruikt. Ze zijn zeer goed gekarakteriseerd.Daarom hebben we deze assay opgezet en geoptimaliseerd, zodat we deze cellen om die redenen konden gebruiken. En interessant genoeg blijkt dat deze endotheelcellen uit grote vaten in kweek de vorm van microvasculaire endotheelcellen lijken aan te nemen. Ze verliezen veel genen die normaal gesproken door endotheelcellen uit grote vaten worden tot expressie gebracht en beginnen genen te expresseren die normaal gesproken geassocieerd worden met microvasculaire endotheelcellen.En ze zijn volkomen in staat om capillair-achtige uitlopers te vormen, lumina te creëren en structuren te maken die er in kweek in alle opzichten uitzien als echte capillairen. Ze zijn dus gemakkelijk te gebruiken en doen precies wat we van ze verwachten. Ze vertonen uitgroei en vormen correct gelumineerde vaten.Wanneer we deze assay willen kwantificeren, zijn er in feite verschillende manieren waarop we dat kunnen doen. We kunnen kijken naar kwantitatieve criteria zoals het aantal uitlopers, de lengte van de uitlopers, de diameter van de uitlopers, het aantal vertakkingspunten en het aantal anastomosen, maar we kijken ook naar kwalitatieve criteria. Zo kunnen we bijvoorbeeld kijken of er lumen worden gevormd.En dat is waarschijnlijk waar we het meest in geïnteresseerd zijn. Bij veel van de assays die we uitvoeren, gaat het om de juiste lumenvorming. Dat is echt meer een kwalitatieve beoordeling, hoewel men daadwerkelijk de diameter van die lumen kan meten naarmate de vaten groter worden.Daarom gebruiken we fibroblasten in deze culturen. We bedden de beads in de fibrinegel in en we plaatsen fibroblasten bovenop de gel. De fibroblasten zijn absoluut essentieel voor een correcte uitstulping en lumenvorming.In afwezigheid van fibroblasten vindt er enige uitloping plaats. De endotheelcellen hebben echter de neiging om niet aan elkaar gehecht te blijven. Wat er gebeurt is dat ze van elkaar wegmigreren.Hierdoor heeft elke structuur die zich op deze uitloper ontwikkelt, de neiging om uit elkaar te vallen. Na enkele dagen ondergaan de endotheelcellen apoptose. Het lijkt er dus op dat fibroblasten factoren produceren die essentieel zijn voor angiogenese, althans in dit in vitro-systeem.En we waren zeer geïnteresseerd in het achterhalen wat die factoren zijn. Wat we hebben ontdekt, is dat de fibroblasten iets in het medium uitscheiden; we kunnen dus geconditioneerd medium van de fibroblasten gebruiken, wat de juiste uitloping en lumenvorming ondersteunt. We hebben hier dus overduidelijk te maken met een oplosbare factor.Het is dus duidelijk dat we zeer geïnteresseerd zijn om te weten wat de fibroblasten produceren dat zo belangrijk is voor angiogenese in dit systeem. We hebben alle gebruikelijke verdachten geprobeerd; VEGF en basic FGF zijn aanwezig in de cultuur, maar het toevoegen van meer hiervan is geen vervanging voor fibroblasten. We hebben ook angiopoëtine 1, TGF bèta, HGF, enzovoort geprobeerd.Tot nu toe hebben we de vitale factor nog niet gevonden. Daarom zijn we nu bezig met het zuiveren van factoren uit het geconditioneerde medium van fibroblasten. We brengen het geconditioneerde medium door verschillende kolommen, waaronder kationenuitwisseling en grootte-uitsluiting, en we verkrijgen fracties daarvan die activiteit vertonen.We volgen nu die activiteit en we nemen die fracties, stellen vast welke actief zijn, en vanuit daar kunnen we deze op gels draaien om er zeker van te zijn dat we slechts een relatief klein aantal banden op de gel hebben, waarna we deze kunnen uitsnijden en via massaspectrometrie laten sequensen. En dat levert ons veel interessante gegevens op. We hebben nu een aantal kandidaatgenen die we individueel testen om te zien of zij daadwerkelijk de factor zijn waarnaar we op zoek zijn.We hebben veel bekende angiogene factoren getest en we weten dat veg GF en basisch FGF in feite essentieel zijn voor de juiste uitlopersvorming in deze assay. Maar zij vormen niet het hele verhaal. Er zijn afgeleide factoren die belangrijk zijn, zoals ik al noemde, en één manier waarop we dit hebben onderzocht is door tumorcellen te gebruiken die in vivo sterk angiogeen zijn; zij genereren grote tumoren in muizen en zijn sterk gevasculariseerd.We hebben deze tumorcellen onderzocht en zij vertonen zeer hoge expressieniveaus van vegf, en we hebben deze aan onze culturen toegevoegd. We hebben de fibroblasten dus vervangen door deze tumorcellen, en zij ondersteunen geen robuuste angiogenese in deze assay. En dat is zeer interessant.Wat dit suggereert, en dit is ook door anderen gesuggereerd, is dat er sprake is van crosstalk tussen de tumor, het stroma, bestaande uit fibroblasten en andere ondersteuningscellen in het weefsel, en de endotheelcellen. Het is zeer goed mogelijk dat tumorcellen factoren produceren die rechtstreeks inwerken op de endotheelcellen, maar ze produceren ook andere factoren die fibroblasten en andere stromale cellen stimuleren om factoren aan te maken die vervolgens ook een robuuste angiogenese ondersteunen.

christopher-hughes-an-vitro-model-for-study-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

University of California, Irvine (UCI).  Christopher CW Hughes beschrijft het nut van zijn cultuur systeem voor het bestuderen van angiogenese in vitro. Hij legt het belang van de fibroblasten dat een kritische, nog niet geïdentificeerde, oplosbare factor die het mogelijk maken endotheelcellen aan schepen in de cultuur vorm die tak, de juiste vorm lumen, en ondergaan anastomose afscheiden.

Christopher Hughes: Een in vitro model voor de Studie van angiogenese (Interview)

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Openbaarmakingen

Herprints en machtigingen

Tags