De Lashley III doolhof is een route-learning taak die niet afhankelijk is van aversieve stimuli of visuele cues. Het is dus een zeer aantrekkelijke optie voor het evalueren van leren en geheugen, vooral in ouder worden muizen of anderszins waar stress is een overweging.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lage-stress Route leren met behulp van de Lashley III Maze in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel gedrag testen ontwikkeld om leren en geheugen bij knaagdieren te evalueren, met name muizen, vertrouwen op visuele cues, voedsel en / of water ontbering, of andere aversieve stimuli om taak overname te motiveren. Als dieren leeftijd, zintuiglijke modaliteiten verslechteren. Bijvoorbeeld, het ontwikkelen van vele stammen van muizen horen tekorten of cataract. Veranderingen in de sensorische systemen die nodig zijn om muizen te begeleiden tijdens taak overname aanwezig potentieel verwart bij het interpreteren van veranderingen in het leren van veroudering dieren. Bovendien is het gebruik van aversieve stimuli om dieren te motiveren om taken te leren is potentieel verstorende bij het vergelijken van muizen met differentiële gevoeligheid voor stress. Het minimaliseren van dit soort verstorende factoren, hebben we een aangepaste versie van de Lashley III doolhof. Dit doolhof is gebaseerd op de route leren, waarbij muizen leren om een doolhof navigeren via herhaalde blootstelling onder lage belasting omstandigheden, bijv. donkere fase, geen eten / water ontbering, totdat ze navigeren een pad vanaf de start locatie naar een pseudo-home kooi met 0 of een fout (en) op twee opeenvolgende proeven. We classificeren dit als een low-stress-gedrag-test, omdat het niet afhankelijk van aversieve stimuli om de verkenning van het doolhof en het leren van de taak te stimuleren. Het apparaat bestaat uit een modulair start box, een vier-armige doolhof lichaam, en een doel box. Aan het eind van het doel box is een pseudo-kooi die bedden vergelijkbaar met die gevonden in het huis van het dier kooi en is specifiek voor elk dier voor de duur van de doolhof testen bevat. Het is al eerder aangetoond dat deze pseudo-kooi voldoende te belonen aan muizen geeft motiveren om te leren het doolhof navigeren
Protocol
1. Bereiding:
- De Lashley III doolhof is gemaakt van plexiglas en is weergegeven in figuur 1. De start box, doolhof armen, en het doel box zijn modulair, zodat voor het reinigen en aanpasbaarheid van het doolhof. De wanden van de start box, doolhof armen, en het doel box zijn gemaakt van zwart plexiglas om visuele signalen te elimineren van buiten en binnen het doolhof. Doolhof armen zijn 45 cm lang, 7 cm hoog en 5 cm breed. Deuren die leiden tot opeenvolgende armen van het doolhof zijn 4 cm x 4 cm en bevinden zich 11 cm van de buitenste muren van het doolhof. Het doel doos is 19,5 cm lang x 7 cm hoog x 5 cm breed. De start box is 8 cm x 9,5 cm x 7 cm. Afzonderlijke duidelijk plexiglas stukken worden geplaatst op de top van de start box, doolhof, en het doel doos om visualisatie van elke muis laten als het vordert door het doolhof terwijl het voorkomen muizen ontsnappen. Het doolhof rust op een basis gemaakt van rood plexiglas, dat is groot genoeg om de drie stukken van het doolhof en een pseudo-kooi, dat is van hetzelfde formaat als standaard van het dier kooi te houden.
- Tot pseudo-home kooien voor te bereiden voor de eerste doolhof proef, verse strooisel van dezelfde soort als die in de dieren 'home kooien wordt toegevoegd aan de individuele kooi bodems met deuren (2 cm x 2 cm) gesneden in de zijkanten. Plaats draad toppen op deze kooi bodems en individueel nummer ze, een voor elk dier in een test cohort. Deze kooien zullen dienen als individuele pseudo-home kooien voor elk dier voor de duur van het testen termijn. Omdat we onderzoek naar de rol van stress en / of angst-gerelateerd gedrag in het leren en het geheugen maken wij gebruik van pseudo-home kooien individueel te voorkomen dat woningen muizen in hun eigen kooien. Echter, als deze factoren niet van primair belang, kunnen dieren afzonderlijk worden gehuisvest in kooien thuis gemodificeerd met deuren en deze kooien kunnen dienen als het huis kooien voor een succesvolle doolhof navigeren.
2. Testen:
- Elke dag worden dieren naar het gedrag testkamer een minimum van een uur voor het testen, zodat ze wennen aan de testomgeving.
- Dertig minuten voor het testen starttijd, voedsel en water wordt verwijderd uit alle kooien huis. Houd het voedsel en water in het gedrag testen kamer, maar buiten het bereik van de muizen. Voedsel en water is meestal verwijderd 30 min na de overgang van de lichte fase naar de donkere fase, na het voeden piek heeft plaatsgevonden. Dit zorgt ervoor dat de dieren zijn meestal voedsel-en water-verzadigd voorafgaand aan de test, maar het testen tijdens deze periode biedt een kleine extra motiverende kracht om het doolhof te navigeren, ook al is er geen openlijke voedsel of water te belonen na voltooiing van de taak.
- Na de 30 minuten pretest termijn is verstreken, het reinigen van de doolhof met 70% ethanol. Laat de deur vanaf het begin doos in het doolhof armen gesloten. De deuren aan beide uiteinden van het doel box zijn open gelaten.
- Plaats de pseudo-kooi die overeenkomt met de eerste dier aan het einde van het doel box.
- Draag de eerste muis naar de doolhof, cupping het in je hand. Zet de muis in het begin doos en plaats de deksel.
- Wanneer in de positie om het doolhof te observeren zonder belemmering, de start box deur open en direct beginnen drie stopwatches.
- Wanneer alle vier de poten van de muis hebben de start box links, sluit de start box deur en stop de eerste timer.
- Opnemen met de hand het pad van de muis reist als het navigeren van de doolhof. Een muis komt een nieuwe zone of een arm van het doolhof wanneer alle vier poten hebben gekruist in dat gebied (zie Fig. 1).
- Wanneer alle vier de poten het doel box in te voeren, sluit de deur die tussen het labyrint en het doel doos en stop de tweede stopwatch.
- Wanneer de muis volledig is de pseudo-kooi ingevoerd, sluit de deur tussen de doelstelling box en de kooi. Stop de derde stopwatch.
- Noteer de tijden van de drie stopwatches. Tel het aantal fouten de muis heeft gemaakt. Een fout wordt gedefinieerd als een toegang tot een doodlopende cul-de-sac zone (bijvoorbeeld, gaande van arm naar L zone K;. Afb. 1) of op reis terug door een reeds reisde arm van het doolhof (bijv., gaande van arm aan arm F C; Fig 1).. Terwijl we scoren muis prestaties als het zich voordoet, is het mogelijk om videoband of op andere wijze opnemen doolhof onderzoeken om voor de volgende scoren toe, hetzij op het oog of door geautomatiseerde software. Experimentator beoordelingsvrijheid te worden gebruikt om een geschikte methode te kiezen.
- Laat het dier in de pseudo-home kooi voor 1 minuut alvorens terug te keren naar haar kooi.
- Herhaal de stappen 2,3 tot 2,12 voor alle muizen in de testen van cohort.
- Wanneer de laatste muis in het cohort is teruggekeerd naar haar kooi, start de 30 minuten timer. Aan het eind van deze 30 minuten periode, terug te keren voedsel en water om alle muizen in de cohort en keer dan terug de dieren naar de kolonie kamer.
- Herhaal deze procedure op opeenvolgende nachten, met een trial testen per dag per dier, totdat alle muizen in de cohort hebben bereikt een bepaalde leer criteria of tot een vooraf bepaald nomber van de test-onderzoeken heeft plaatsgevonden. Een muis is geclassificeerd als geleerd het doolhof wanneer het kan de taak uit te voeren met 0 of 1 fout (en) op twee opeenvolgende proeven. Muizen worden getest in dezelfde volgorde op de opeenvolgende proeven.
3. Representatieve resultaten:
Dagen om te leren (te bereiken criterium) kan worden geanalyseerd en vergeleken tussen verschillende groepen in een bepaalde studie (afb. 2A en 3A). Bovendien kan een leren-index (leer-ratio), die doolhof acquisitie kenmerkt, worden geëvalueerd in de eerste vier dagen van de testperiode (figuren 2B en 3B). Het leren index is de verhouding van het aantal juiste pad segmenten reisde naar het totale aantal padsegmenten reisde voor elke proef. De gemiddelde leren index moet ongeveer 0,5 zijn voor proef 1, wanneer de muizen eerst worden blootgesteld aan het doolhof en het navigeren door het toeval. Het leren index stijgt en benaderingen een tussen de proeven 2 en 4 te geven dat het leren plaatsvindt. In figuur 2, jonge (2 mo) en ouder (24 ma) mannelijke C57Bl/6NCr muizen werden getraind op de Lashley doolhof voor maximaal 15 trials. De jonge muizen leerden het doolhof in 7.2 (± 1.5) d. Daarentegen, de vergrijzing van de dieren nam 11,7 (± 2,1) d criterium te bereiken. Er was een sterke trend voor de veroudering C57Bl/6NCr muizen langer duren om het doolhof ([t (23) = 1,59, p = 0.056] te leren, een eenzijdige t-test, a priori hypothese die dag om te leren is langer bij veroudering muizen). Wanneer het leren index wordt berekend, beide leeftijdsgroepen tonen een gestage toename van het leren-index van de proeven 2 tot en met 4 (significant hoofdeffect van de tijd P <0.001). Er waren echter geen statistisch significante verschillen in het leren index tussen jonge C57 muizen en oude C57 muizen (belangrijkste effect van de leeftijd P = 0,58).
Figuur 3 representatief is voor studies naar het effect van de achtergrond druk op het leergedrag. Gegevens van de jonge mannelijke C57Bl/6NCr getoond in Fig. 2 worden nu vergeleken met gegevens uit jonge Crl: CD-1 (ICR) BR muizen [CD-1, 4-5 mo]. CD-1 muizen leerde de Lashley III doolhof in 4.5 (± 1.4) d, maar er was geen significant verschil tussen de stammen in de dagen om te leren (Fig. 3A, [t (18) = 1.328, P = 0.20]; twee -tailed t-test). Bij onderzoek van het leren-index laat zien dat, hoewel alle dieren waren het navigeren in de doolhof van de eerste proef door het toeval, CD-1 muizen leerden de taak sneller (belangrijkste effect van de stam P <0.001). Dit wordt geïllustreerd door de statistisch significante stijging van de index in het leren proeven 2 tot en met 4 in CD-1 muizen in vergelijking met C57Bl/6NCr muizen. Interessant, als CD-1 muizen verder te worden opgeleid in het doolhof voorbij het punt van het bereiken van criteria, ze vertonen gedrag wijzen op overtraining (afb. 4), die wordt besproken in meer detail beschreven.
Figuur 1:. De Lashley III doolhof De doodlopende cul-de-sac zones van het doolhof zijn rood gekleurd in dit schema alleen voor illustratieve doeleinden. De basis en de armen van de huidige doolhof zijn vaste kleuren (inzet). Het doolhof is getekend op schaal (afmetingen in tekst).
Figuur 2: Lashley III doolhof prestaties in 2 en 24 maanden oude mannelijke muizen C57Bl/6NCr De Lashley III doolhof werd gebruikt om te beoordelen route leren van jonge (2 mo) en ouder (24 ma) mannelijke C57Bl/6NCr muizen.. De gemeten parameters waren (een) dag criterium, het aantal dagen dat nodig is voor een muis naar het doolhof lopen voor twee opeenvolgende nachten met 0 fouten of een fout, en (b) leren index, het aantal correcte vier-poot arm entries gemaakt ten opzichte van het totaal aantal inschrijvingen arm gemaakt op dag 1-4 van Lashley III doolhof testen. Aantallen dieren per groep werden n = 10 voor 2 maanden oud en n = 15 voor 24 maanden oude muizen.
Figuur 3: Lashley III doolhof prestaties in jonge mannelijke C57Bl/6NCr en CD-1 muizen De Lashley III doolhof werd gebruikt om de route te beoordelen leren in twee maanden oude C57Bl/6NCr en 4-5 maanden oude CD-1 muizen.. De gemeten parameters waren (een) dag criterium, het aantal dagen dat nodig is voor een muis naar het doolhof lopen voor twee opeenvolgende nachten met 0 fouten of een fout, en (b) leren index, het aantal correcte vier-poot arm entries gemaakt ten opzichte van het totaal aantal inschrijvingen arm gemaakt op dag 1-4 van Lashley III doolhof testen. Aantallen dieren per groep werden n = 10 voor C57Bl/6NCr en n = 10 voor CD-1 muizen. Statistische betekenissen: * P <0,05, ** P <0,01 versus C57Bl/6NCr muizen.
Figuur 4: Lashley III doolhof prestaties in 4-5 maanden oude mannelijke CD-1 muizen De Lashley III doolhof.werd gebruikt om te beoordelen route leren in tien 4-5 maanden oude mannelijke CD-1 muizen op 15 opeenvolgende dagen. De gemeten parameters waren (a) aantal gemaakte fouten per dag, met een fout gedefinieerd als een vier-poot binnenkomst in een doodlopende cul-de-sac zone of het reizen een reeds reisde arm van het doolhof, en (b) de tijd doorgebracht in de doolhof per dag. De dag waarop criterium werd bereikt wordt aangegeven met een rode pijl.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest gebruikte knaagdieren gedragstesten om te leren en geheugen te beoordelen zijn de Morris water maze en varianten van vreesconditionering 2. Deze tests vertrouwen op visuele of auditieve signalen om te leren en aversieve stimuli (bijvoorbeeld water, footshock) voor dieren te motiveren om de taken te voltooien 3. Bij veroudering knaagdieren, zoals bij veroudering mensen, zintuiglijke modaliteiten verloop van tijd afnemen. Verschillende achtergrond stammen van muizen verliezen hun gehoor of d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle gedrag protocollen werden goedgekeurd door de Pennsylvania State University Institutional Animal Care en gebruik Comite. Er zijn geen financiële informatie te melden.
Dankbetuigingen
De Lashley III doolhof gebruikt voor deze experimenten werd gebouwd door Tim Bowmaster, Paul Corman, Barry Dutrow, Ryan Jabco, en Tim Treaster van de Pennsylvania State University Physics Department Machine Shop. De auteurs willen graag aan mevrouw Shoba Belegundu, mevrouw Tara Chrzanowski, en mevrouw Alexandra Lewis bedanken voor de hulp bij het uitvoeren van de experimenten die in de figuren 2-4. De heer Walter Jackson waardevolle feedback in de voorbereiding van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door de financiering van het National Institute of Mental Health (MH064756 en MH077978 naar AMA). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Mental Health en de National Institutes of Health.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Lashley III doolhof | PSU Physics Machine Shop | N/A | Doolhof moet op maat worden gebouwd, niet commercieel verkrijgbaar |
Referenties
- Blizard, D. A. Return to home cage' as a reward for maze learning in young and old genetically heterogeneous mice. Comparative Med. 56, 196-201 (2006).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse?: Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd ed, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Blizard, D. A., Klein, L. C., Cohen, R., McClearn, G. E. A novel mouse-friendly cognitive task suitable for use in aging studies. Behav. Genet. 33, 181-189 (2003).
- Warren, J. Appetitive learning by old mice. Exp. Aging Res. 12, 99-105 (1986).
- Lashley, K. Brain mechanisms and intelligence: A quantitative study of injuries to the brain. , University of Chicago Press. Chicago. (1929).
- Barnes, C. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Comp. Physiol. Psych. 93, 74-104 (1979).
- Matzel, L. D. Individual differences in the expression of a general learning ability in mice. J. Neurosci. 23, 6423-6433 (2003).
- Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci. 48, 29-69 (1989).
- Hepler, D. J., Wenk, G. L., Cribbs, B. L., Olton, D. S., Coyle, J. T. Memory impairments following basal forebrain lesions. Brain Res. 346, 8-14 (1985).
- Sci, B. ehavB. rain 2, 313-313 (1979).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
