Zuivering van het M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome geassocieerd eiwit MamAΔ41

Samenvatting

Mama is een uniek Magnetosome geassocieerd eiwit dat werd aangetoond dat het betrokken is bij magnetosome activering. Hier presenteren we de zuivering protocol van Mama deletiemutant (MamAΔ41) van M. magneticum AMB-1.

Samenvatting

Magnetotactic bacteriën vormen een diverse groep van aquatische micro-organismen die in staat zijn om zich te oriënteren langs geomagnetische velden. Dit gedrag wordt verondersteld om hun zoektocht naar geschikte omgevingen hulp

Protocol

1. Klonering en expressie van Mama Gene in E. coli

De mutant gen mamAΔ41 werd geamplificeerd met behulp van de polymerase chain reaction (PCR) van genomisch DNA van Magnetospirillum magneticum AMB-1, met primers: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'en 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. In het geamplificeerde DNA-fragmenten, was een Ncol website geïntroduceerd op de initiatie codon ATG en de beëindiging codon werd vervangen door een ScoI site. De fragmenten werden gedigereerd met Ncol en Sacl en gekloneerd in de respectieve sites van pET52b (+), die aanleiding geven tot pET52bMamAΔ41-AMB1. In dit construct, was de mamAΔ41 gen gefuseerd in-frame met de 10-Zijn tag aan het C-terminus. Het plasmide werd geëlektroporeerd in E. coli-stam BL21. E. coli-stam BL21 herbergen pET52bMamAΔ41 werd gekweekt in auto-inductie (15) medium met ampicilline (50 mg / ml) 310 ° K voor 3 uur. De teelt temperatuur werd daarna verlegd van 310 ° tot 300 ° K en onderhouden voor een extra 48 uur bij 300 ° K. De cellen werden geoogst door centrifugatie bij 5465g gedurende 10 minuten bij 277 ° K. 8 liter cultuur geproduceerd 60 gram natte cel pellet.

2. Bioinformatica Berekeningen

Berekeningen van moleculair gewicht (MW), volgens aminozuren volgorde en de voorspelde opname van 1mg/1ml van eiwitten in 280nm, met behulp van de ProtParam server (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Voor 10His-Tag-MamAΔ41 de MW is 22.529 Da (240 aminozuren) en voor MamAΔ41 (met negen aminozuren links na His-tag verwijdering door trombine) de Mw is 20596.5Da (187 aminozuren). De voorspelde opname van 1mg/1ml van eiwitten in 280nm voor 10His-Tag-MamAΔ41 is 0,595 en voor MamAΔ41 is 0,579. Bovendien is de aminozuursequentie bevatten geen cysteïne residuen. Daarom zijn reductiemiddelen niet nodig tijdens het zuiveringsproces.

3. Zuivering van MamAΔ41

1. Voor stamoplossingen, afwegen en voor te bereiden (200 ml per stuk) in de volgende concentraties: Imidazool (MW 228,2 g / mol) 4M-oplossing, NaCl (Mw 58,44 g / mol) 5M oplossing, Tris-HCl (Mw 121,3 g / mol ) 1M-oplossing, de pH = 8. Voeg dubbel gedestilleerd water (DDW) en meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is. Filter oplossingen met 0.22μm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
2. Voor te bereiden en filter 6 verse buffers uit voorraad oplossingen (Tabel 1).
3. Verdunnen en te schorten cellen in buffer A in 1:2 verhouding, gram van de cellen om buffer volume (ml).
4. Voeg 10μl voor elk 10gr van bacteriën van DNase I (1 mg / ml) om DNA-fragmenten te breken in het monster. Voeg 1 ml voor elke 20gr van bacteriën van EDTA vrij proteaseremmer cocktail. Incubeer gedurende 20 min. op ijs.
5. Verstoord cellen door twee cycli van de Franse pers op 25.000 psi. In tegenstelling tot sonicatie, is de Franse pers die gericht zijn op een hoog volume (> 10 ml) cel extrusie door het forceren van de cellen onder hoge druk door een dunne opening. De zuiger moet worden gekoeld op ijs tien minuten voor het gebruik ervan en assemblage ten gevolge van temperatuur opbouw.
6. Breng de gelyseerde cellen in 25 ml ultracentrifuge buizen en nauwkeurig evenwicht tussen hen (50 mg) met buffer A totdat het monster bereikt de buis s hals.
7. Aparte cel puin door Ultra centrifugeren bij 270.000 g gedurende 1 uur bij 277 ° K.
8. Bereid een zelfgemaakte zwaartekracht Ni NTA kolom (2,5 cm diameter) door het toevoegen van 4 ml van Ni NTA hars, die worden bewaard in 20% ethanol, op de kolom. Volledig Laat de vloeistof laten vallen, daarna wassen met 40 ml van de DDW en volledig laat de vloeistof vallen. Pre-evenwicht van de hars in de kolom met 40 ml buffer A.
9. Breng de oplosbare fractie van ultra-centrifugatie buizen op de zwaartekracht Ni NTA kolom. Laat de vloeistof laten vallen, het verzamelen van doorstroom (ongebonden eiwitten) en stand te houden bij 277K.
10. Verzamel pellet monster van de ultra-centrifugatie buizen met behulp van een kleine tip om de pellet schroot. Meng de tip in 50μl van 5% β-mercapto-ethanol in 2X SDS-PAGE sample buffer.
11. Was de kolom met 100 ml buffer B. Laat de vloeistof laten vallen, het verzamelen van doorstroom en het behoud van 277K.
12. Bereid 15 gemarkeerd Eppendorf-buisjes (1,5 ml).
13. Elutie - sluit kolom ventiel en vervolgens 1 ml buffer C op de kolom lading; incubeer gedurende 3 minuten, gevolgd door ventiel openen en flow-through collectie. Herhaal deze stap drie keer.
14. Elueer rest van de suspensie bij 1 ml buffer C stappen en sluit de klep.
15. Meet OD bij 280nm van de fracties en evalueren van de locatie van het eiwit piek, als de OD is nog steeds> 0,3, aanvullende monsters nodig zijn.
16. SDS-PAGE analyse van de verzamelde fracties. Bij deze analyse moet ook worden uitgevoerd met de volgende monsters, niet-gebonden eiwitten doorstroom, was doorstroming en ultra centrifugeren pellet monster. Meng 10μl van elk monster met een 10μl van 5% β-mercapto-ethanol in 2X SDS-PAGE sample buffer. Laad de samples op 15% SDS-PAGE en lopen gedurende 45 min in 180 Volt.
17. Vlekken op de gel in 15 ml van InstantBlue oplossing, schudden gedurende 1 uur. Zorg ervoor dat de plastic doos is afgedekt en beschermd tegen licht.
18. Evalueer gel, als eiwit-expressie is hoog en specifiek op basis van het indicatieve bands, samen te voegen geselecteerde geëlueerde fracties.
19. Om de 10-His-tag te verwijderen, toe te voegen runder trombine (10 eenheden / ul), 10μl trombine per 1 mg eiwit, volgens de fabrikant de aanbeveling aan de gecombineerde steekproef.
20. Dialyse wordt gebruikt voor het overschot van Imidazool verwijderen en te NaCl-concentraties voor de niveaus die nodig zijn tijdens ionenuitwisseling binding te verminderen. Voor dialyse, knip de gewenste lengte van 7 kD moleculair gewicht afgesneden (MWCO) dialyse slang. Wassen met DDW en maak een knoop aan een uiteinde (of zegel met clips). Overdracht samengevoegd eiwitoplossing op de zak terwijl wat ruimte aan de bovenkant en klem omhoog.
21. Dompel de dialyse slang in 4 liter gekoeld dialyse buffer (buffer D). Roer de oplossing langzaam over nacht bij 277 ° K.
22. Neem de dialyse slang uit de beker, maakt een kleine snee en de overdracht van het eiwit tot 50 ml buis.
23. Ionenwisselingschromatografie: monteren voorverpakte MonoQ 4.6/100 PE kolom op Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC). Was de kolom met 5 kolomvolumes (CV) van DDW gefilterd water. Geëquilibreerd de kolom met 5 CV van buffer D.
24. Was de injectie-loop met DDW (twee loop volumes) en herhaal dit met een buffer D. Leg het eiwit in de injectie lus.
25. Injecteer het eiwit sample (debiet van 1 ml / min) en beginnen met het verzamelen van fracties voor SDS-PAGE detectie van onbegrensde eiwitten.
26. Indien de initiële eiwit volume (stap 3.23) groter is dan injectieblok, herhaalt u de stappen 3,25-3,26, zonder dat het wassen van de lus, totdat het gehele monster wordt geladen op kolom.
27. Was de kolom met 3 CV van buffer C om onbegrensde eiwitten te verwijderen.
28. Elueer het eiwit met een 60 minuten lineaire gradiënt van 40 2000mm NaCl tussen buffers D & E (bij 100% buffer E is het einde van de gradiënt), debiet 1 ml / min (hoewel hogere debieten kan gebruikt worden in de kosten van grotere volumes, maar minder geconcentreerd, eiwit pieken). Verzamel eiwitten pieken zoals ze in de 280nm chromatogram.
29. Schone voorverpakte kolom volgens de aanbeveling van de fabricage.
30. SDS-PAGE analyse van de verzamelde fracties. Bij deze analyse moet worden uitgevoerd met de volgende monsters, onbegrensde eiwitten doorstroom-en eiwit pieken flow-through. Voer het SDS-PAGE en vlekken zoals vermelding in stappen 3,17-3,18.
31. Evalueer gel voor eiwitbanden bestaan ​​op de voorspelde Mw volgens het eiwit pre-gekleurde marker. Samenvoegen geselecteerde elutie fracties dat de relevante eiwitten bevatten.
32. Dialyze de samengevoegde monsters, om NaCl-concentraties die nodig zijn voor de size exclusion chromatografie lager. Voer de dialyse, zoals vermeld in de stappen 3.21-3.23 tegen buffer F.
33. Concentreer het eiwit monster met behulp van een Vivaspin-15 10.000 MWCO tot 8 mg / ml in een tabel centrifuge, 4000 toeren per minuut. Valideren wens concentratie door het meten van OD bij 280nm in kwarts cuvet. Als het eiwit is te geconcentreerd verdunnen met buffer F en meet opnieuw.
34. Monteer size exclusion voorverpakte kolom HiLoad 26/60 Superdex 200, op FPLC, spoel de kolom met 3 CV van DDW gefilterd water. Geëquilibreerd de kolom met 3 CV van buffer F.
35. Was injectie lus met 5ml DDW (twee lus volumes), gevolgd door een gelijk volume met een buffer F. Plaats niet meer dan 4 ml van het eiwit monster in de injectie lus.
36. Injecteer het eiwit sample (debiet van 3,5 ml / min) en beginnen met het verzamelen eiwitten piek fracties zoals ze het de 280nm chromatogram. Laat de buffer stromen totdat deze kolom volume.
37. Indien de initiële eiwit volume (stap 3.23) groter is dan injectieblok, herhaalt u de stappen 3,25-3,26, zonder dat het wassen van de lus, totdat het gehele monster wordt geladen op kolom.
38. Schone voorverpakte kolom volgens de productie aanbeveling.
39. SDS-PAGE analyse van de verzamelde fracties. Bij deze analyse moet worden uitgevoerd met het eiwit pieken monsters. Voer het SDS-PAGE en vlekken zoals vermelding in stappen 3,17-3,18.
40. Evalueer gel: als eiwit pieken specifiek zijn, in de juiste voorspelde Mw volgens het eiwit pre-gekleurde marker en slechts een band is zichtbaar samenvoegen geselecteerd geëlueerde fracties van het betreffende eiwit.
41. Concentreer je eiwit monster met behulp van een Vivaspin-15 10.000 MWCO tot> 20 mg / ml in een tabel centrifuge, 4000 toeren per minuut. Valideren wens concentratie door het meten van OD bij 280nm. Het gezuiverde MamAΔ41 werd daarna geconcentreerd tot 26,5 mg / ml voor kristallisatie.
42. Bevestig monster zuiverheid en eiwit identificatie met behulp van Matrix-assisted laser desorptie / ionisatie (MALDI-TOF).
43. Als het eiwit wordt gezuiverd volgens de massa-spectrometer en SDS-PAGE, verdeel de geconcentreerde MamAΔ41 vooraf gemarkeerde Eppendorf buizen; 25-50μl eiwit in elk.
44. Flash ingevroren in vloeibare stikstof en bewaar bij 193 ° K.

4. Representatieve resultaten

Wanneer dit protocol correct wordt gedaan een moeten krijgen sterk gezuiverde, grootte homogeen en geconcentreerd eiwit monsters. Deze eiwitten monsters zijn dan klaar voor kristallisatie onderzoeken, alsook biochemische studies, zoals enzymkinetiek, bindingsaffiniteit en nog veel meer. Hier beschreven zijn representatief voor de resultaten van de belangrijkste stappen in de zuivering protocol. SDS-PAGE-analyse van elutieprofiel van de Ni-NTA affiniteit kolom moet zeer laten zien dan tot expressie gebrachte eiwit in de oplosbare fractie op passende MW van ~ 22kDa (figuur 1). Deze SDS-PAGE analyse moet ook zien als een minimum-eiwit in de onbegrensde eiwitten doorstroom, flow-through wassen en ultra-centrifugatie pellet monster. Als grote bands van het juiste eiwit lijken in deze monsters een buffer zou moeten overwegen verkeerde voorbereiding, problemen in cel verstoring of problemen in cultuur auto-inductie voorwaarden en groei.

Ionenuitwisselingschromatografie is voorgevormd om tussen onze wenselijk eiwitten gescheiden van andere E.coli eiwitten die gebonden waren aan de nikkel-hars (als gevolg van elektrostatische interacties of histidine / negatieve aminozuren rijk eiwit loops) en onversneden His-tag wenselijk eiwit. In deze kolom scheidt eiwitten op basis van hun bindingsaffiniteit met de positief geladen hars onder toenemende NaCl concentraties. Zeer negatief geladen eiwitten zullen elueren in hogere concentraties NaCl appose aan negatief geladen deeltjes matig. De voordelen van deze kolom zijn hoog debiet en bindend vermogen. De ionenuitwisseling chromatogram (figuur 2) blijkt dat er een goede scheiding tussen de 3 eiwitten bevolkingsgroepen in toenemende NaCl concentratie. SDS-PAGE-analyse is nodig om MW van elke populatie te bepalen, het isoleren van de wenselijke en de evaluatie of verdere zuivering stappen nodig. De eerste bevolking is MamAΔ41 (~ 20 kDa), terwijl de tweede populatie is MamAΔ41 + Zijn Tag (~ 22kDa) die niet was gesplitst door runder trombine en de derde bevolking is niet op te sporen in SDS-PAGE als gevolg van een lage concentratie. Als de eiwitten pieken niet duidelijk van elkaar zou moeten overwegen een verkeerde buffer voorbereiding of het veranderen van de helling van NaCl gradiënt.

Size exclusion chromatografie is voorgevormd om te scheiden tussen onze wenselijk eiwitten naar andere E. coli-cel eiwitten die gebonden waren aan de Ni-NTA-hars en waren niet gescheiden tijdens ionenuitwisselingschromatografie. In deze kolom scheidt eiwitten op basis van hun grootte. Grote eiwitten elueren in kleinere elutievolume tegenstelling tot de kleine, die zal worden geëlueerd in grotere volumes. De kolom chromatogram (figuur 3) blijkt dat er een goede scheiding van de gewenste eiwit als een grote bevolking. De bevolking lijkt in passende monomeer grootte elueren met een MW van ~ 20 kDa. De aanwezigheid van ~ 80 kDa band (E.coli typisch eiwit dat de Ni-NTA-hars bindt) is gedetecteerd in SDS-PAGE voorafgaand aan de kolom laden en verdwijnt tijdens deze run. Omdat de concentratie van dit ~ 80 kDa eiwit is laag om te beginnen, heeft zijn bevolking niet in het chromatogram als gevolg van de verdunning en SDS-PAGE analyse is nodig om het zuiveringsrendement te bepalen. Wij raden het laden van een verdund en geconcentreerd monster van de belangrijkste piek tot de SDS-PAGE, zodat men kon zeker vast te stellen op de aanwezigheid van een zuivere eiwit in de juiste MW. In dit stadium het eiwit wordt gezuiverd en de homogeniteit moeten worden geëvalueerd door de MALDI-TOF. Deze analyse toonde een eiwit in MW van 20.347 Da en een andere in Mw van 10.176 Da (figuur 4). Het ~ 10 kDa eiwit is de ~ 20 kDa eiwit verdubbeld gebracht. De voorspelde MW van MamAΔ41 met de 9 aminozuren links na His-tag verwijderen was 20596.5 Da. Door het te vergelijken met de verkregen MALDI-TOF MW vonden we dat ze 248 Da elkaar. Dit verschil kan het gevolg zijn van MALDI-TOF meetfouten en / of als gevolg van gemeenschappelijke degradatie van het eerste methionine en de tweede glycine. Tot slot, is het eiwit zeer gezuiverde en kan worden gebruikt voor verdere experimenten.

Tabel 1. Buffer formuleringen.

Figuur 1. Vertegenwoordiger van SDS-PAGE analyse van de Ni-NTA kolom zuivering Van rechts naar links;. P-ultra-centrifuge pellet (3,11 protocol stap), W-wash (3.12-protocol stap), U-onbegrensde eiwitten (3,10 protocol stap), E- vijf rijstroken van elutie samples (3,14 protocol stap), M - eiwit marker (getallen geven MW). Pijl geeft MamAΔ41.

Figuur 2. Analyse van de ionenuitwisselingschromatografie stap (a) Ionenwisseling (MonoQ kolom) chromatogram; Blue - absorptie 280nm, vertegenwoordigt eiwitconcentratie, Green-NaCl concentratie, Rood - indicatie van de verzamelde fracties. (B) Representatieve SDS-PAGE analyse van de ionenuitwisseling zuiveringsstap. Van links naar rechts; M - eiwit marker (getallen geven Mw), A6 - eerste piek fractie, A8-tweede piek fractie.

Figuur 3. Size exclusion chromatografie-analyse (een) Maat uitsluiting (Superdex 200 kolom) chromatogram; Blue - absorptie 280nm, vertegenwoordigt eiwitconcentratie, Red indicatie van de verzamelde fracties. (B) Representatieve SDS-PAGE-analyse van de grootte uitsluiting zuiveringsstap. Van links naar rechts; M-proteïne marker (getallen geven MW), Prei-pre-geïnjecteerde monster, A4-6 in combinatie fractie verzameld van de eerste piek, A4-6D-Verwaterde fractie verzameld uit de piek.

Figuur 4. Matrix-assisted laser desorptie / ionisatie (MALDI-TOF) massaspectrum van het gezuiverde MamAΔ41. De matrix is Sinapic zuur (SA). MamAΔ41 getoond bij 20.347 Da, ook getoond is de verdubbeling van geladen deeltjes van MamAΔ41 op 10.176 Da.

Discussie

Eiwitzuivering is de belangrijkste stap in elk eiwitten biochemische of structurele studies. Omdat elk eiwit is uniek met zijn eigen gedrag, moet men de eigenschappen bepalen en dienovereenkomstig aan te passen zijn zuivering. Eiwit doel moet worden geanalyseerd als een eerste stap in de richting van zuivering met behulp van bioinformatica tools. Ze worden gebruikt om het doel iso-elektrisch punt te berekenen, zijn nodig voor het verminderen / oxiderende omgeving en de behoefte aan speciale ionen / liganden te beoordele...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
French press	Apparatuur	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-078A
Drukvat	Apparatuur	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032
Ultracentrifuge	Apparatuur	Sorvall, Thermo Scientific	Discovery 90SE
Rotor	Apparatuur	Beckman Coulter Inc.	Ti60
Ultracentrifugebuizen; PC-Bottle+Cap Assay 26,3ml	Apparatuur	Beckman Coulter Inc.	BC-355618
Glazen Econo-Column chromatografiekolommen, 2,5cm diameter	Apparatuur	Bio-Rad	737-2521
Ni-NTA His Bind hars	Apparatuur	Novagen, EMD Millipore	M0063428
Spectrofotometer	Apparatuur	Amersham	Ultraspec 2100 pro
Kwarts cuvette	Apparatuur	Hellma	104-QS
Fast Protein Liquid Chromatography- AKTA purifier 10	Apparatuur	GE Healthcare	28-4062-64
Ionenuitwisselingskolom – MonoQ 4,6/100 PE	Apparatuur	GE Healthcare	10025543
Voorgevulde size-exclusion kolom-HiLoad 26/60 Superdex 200	Apparatuur	GE Healthcare	17-1071-01
Centricon - Vivaspin15 – 10.000 MWCO	Apparatuur	Sartorius AG	VS1501
Tafelcentrifuge	Apparatuur	Thermo Fisher Scientific, Inc.	IEC CL30R
MALDI-TOF	Apparatuur	Bruker Corporation	Reflex IV
Tris-HCl (hydroksymethyl)aminomethaan	Reagens	BioLab	20092391
Natriumchloride	Reagens	FRUTROM	235553470
Imidazole	Reagens	Alfa Aesar	288-32-4
EDTA-vrije protease-remmermix	Reagens	Sigma-Aldrich	P-8849
Dnase I (Deoxyribonuclease I)	Reagens	Sigma-Aldrich	DN-25
Bovien thrombine	Reagens	Fisher Scientific	BP25432
Glycine	Reagens	BioLab	07132391
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Reagens	BioLab	19822391
Bèta-mercapto–ethanol	Reagens	Sigma-Aldrich	M-3148
InstantBlue	Reagens	Expedeon	1SB01L
PageRuler voorgekleurde eiwitladder	Reagens	Fermentas	SM0671