Deze video toont het protocol van een in vitro angiogenese test die recapituleert verschillende stadia van angiogenese. Time-lapse beelden van kiemen, lumen vorming, vertakking en anastomose - belangrijkste kenmerken van angiogenese - worden weergegeven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geoptimaliseerde fibrinegel Bead Assay voor de Studie van Angiogenese
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Angiogenese is een complexe multi-step proces, waarbij, in antwoord op angiogene stimuli, nieuwe schepen worden gemaakt van de bestaande bloedvaten. Deze stappen zijn: afbraak van de basale membraan, proliferatie en migratie (ontspruiten) van endotheelcellen (EC) in de extracellulaire matrix, de uitlijning van de EC in de koorden, vertakking, lumen vorming, anastomose, en de vorming van een nieuwe kelder membraan. Velen in vitro testen zijn ontwikkeld om dit proces te bestuderen, maar de meeste alleen maar na te bootsen bepaalde stadia van de angiogenese, en morfologisch de schepen binnen de tests vaak niet lijken op schepen in vivo. Op basis van eerder werk van Nehls en Drenckhahn, hebben we een geoptimaliseerd in vitro angiogenese-test dat de menselijke navelstreng EG en fibroblasten gebruikt. Dit model recapituleert alle van de belangrijkste vroege stadia van angiogenese en, belangrijker nog, de schepen weer te geven patent intercellulaire lumen, omringd door gepolariseerd EC. EG worden gecoat op cytodex microdragers en ingebed in een fibrine gel. Fibroblasten zijn gelaagd op de top van de gel, waar zij nodig oplosbare factoren die de bevordering van EG-ontspruit uit het oppervlak van de kralen. Na een aantal dagen, talloze schepen aanwezig zijn die gemakkelijk kunnen worden waargenomen onder fase-contrast-en time-lapse microscopie. Deze video toont de belangrijkste stappen bij het opzetten van deze culturen.
Protocol
VOORBEREIDEN CELLEN
- Brengen HUVEC en fibroblasten in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 dagen voor de kralen.
- Schakelaar middellange tot EGM-2 (Clonetics) de dag voor beading voor HUVEC en de dag voor inbedding van fibroblasten.
- Een concentratie van ~ 400 HUVEC per kraal is nodig.
- 20.000 fibroblasten per goed is nodig.
Coaten van de parels MET HUVEC - dag-1
- Trypsinize HUVEC.
- Laat kralen om zich te vestigen (NIET CENTRIFUGE!). Zuig het supernatant en kort was de kralen in een ml warm EGM-2 medium.
- Mix 2500 kralen w / 1x10 6 HUVEC in 1,5 ml warm EGM-2 medium in een FACS buis. Verticaal plaats het in de incubator. (Dit zal genoeg zijn voor ~ 10 wells. Schaal indien nodig)
- Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C, het schudden van de buis om de 20 minuten. (Een goede coating is van cruciaal belang voor kiemen.)
- Na 4 uur, de overdracht van de gecoate parels aan een T25 kolf in 5 ml van de EGM-2 en laat O / N.
INBEDDING gecoate parels in fibrine GEL - DAG 0
- Bereid de 2,0 mg / ml fibrinogeenoplossing (zie recept sectie).
- Voeg 0,15 Eenheden / ml aprotinine aan de fibrinogeen-oplossing.
- Transfer gecoate kralen om een 15 ml conische buis en laat de kralen af te wikkelen. Resuspendeer kralen in 1 ml van de EGM-2 en transfer naar een 1,5 ml centrifuge buisje.
- Was de kralen 3X met 1 ml van EGM-2 door pipetteren op en neer LANGZAAM.
- Rekenen kralen aan een dekglaasje en resuspendeer in fibrinogeen-oplossing bij een concentratie van ~ 500 kralen / ml.
- Voeg toe 0.625 Eenheden / ml trombine aan elk putje.
- Voeg 0,5 ml van de fibrinogeen / kraal ophanging aan elk putje van een 24-well plaat.
Wijzig de pipetpunt voor elk goed! - Meng de trombine en de fibrinogeen door te gaan op en neer voorzichtig met de pipetpunt ~ 4 tot 5 keer. Wees voorzichtig om geen grote bubbels te maken.
- Laat de plaat gedurende 5 minuten in de motorkap, en plaats deze in de 37 ° C-incubator voor 10-15 minuten tot een stolsel te genereren.
- Tijdens het wachten op het stolsel, trypsinize fibroblasten.
- Voeg 1 mL van EGM-2 per well druppelsgewijs.
- Zaad fibroblasten op de top van fibrine-gel met een concentratie van 20.000 cellen per well.
OPMERKINGEN:
Meestal, wanneer de fibrine gel is gevormd, ziet u kleine luchtbelletjes in de gel. Maak je geen zorgen, zullen ze verdwijnen in 3-4 dagen.
Wijzig de media om de andere dag, dat wil zeggen, Dag 2, 4, 6, enz. ..
Op dag 3 of 4 moet je beginnen te zien kiemen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er is een groeiende consensus dat de drie-dimensionale (3D) in vitro angiogenese assays een model dat veel dichter bij de werkelijke omgeving in vivo dan kan worden bereikt met behulp van 2D-culturen aan te bieden. Het is duidelijk dat een superieure 3D-systemen moet reproduceerbaar zijn, en in staat zijn om een aantal van de belangrijkste stappen van angiogenese na te bootsen. Terwijl verscheidene eerdere 3D-testen zijn ontwikkeld, veel van deze beide te gebruiken hard-to-verkrijgen van microvasculair cellen, of slechts recapituleren een...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Cytodex-3 beads | Reagens | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/fles. 1. Hydrateer en laat 0.5 g droge beads zwellen in 50 mL PBS (pH = 7.4) gedurende ten minste 3 h bij RT. Gebruik een 50 mL buis en plaats deze op de rocker. 2. Laat de beads bezinken (~ 15 min). Verwijder het supernatant en was de beads enkele minuten in verse PBS (50 mL). 3. Verwijder de PBS en vervang deze door verse PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL of 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/mL. 4. Plaats de beadsuspensie in een gesiliconiseerde glazen fles (Windshield Wiper of Sigmacote). 5. Steriliseer de beads door autoclaveren gedurende 15 min bij 115°C. 6. Bewaar bij 4°C. |
| Aprotinine | Reagens | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/fles. Reconstitueer geliofiliseerd aprotinine tot 4 U/mL in DI-water. Steriel filteren. Maak aliquoten van elk 1 mL. Bewaar bij -20 °C. |
| Fibrinogeen Type I | Reagens | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Los 2 mg/mL fibrinogeen op in DPBS. Noteer het % stolbaar eiwit en pas dit dienovereenkomstig aan. Verwarm in een waterbad van 37 °C om het fibrinogeen op te lossen. Meng door de buis om te keren. Niet vortexen. Steriel filteren via 0.22 µm. |
| Trombine | Reagens | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1.000 units. Reconstitueer in steriel water tot 50 U/mL. Maak aliquoten van elk 0.5 mL. Bewaar bij -20 °C. |
Referenties
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
