Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Debarati Mukherjee; Arpita Sen; R. Claudio Aguilar

doi:10.3791/1863

Method Article

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

DOI:

10.3791/1863

⸱

March 24th, 2010

Debarati Mukherjee¹ , Arpita Sen¹ , R. Claudio Aguilar¹

¹Department of Biological Sciences and Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. Cultuur van de Cel en Proteïne Inductie

Dit hoofdstuk beschrijft celkweek voorwaarden, cel-cyclus synchronisatie met Nocodazole, gevolgd door inductie van eiwitexpressie van een reguleerbare promotor in gistcellen.

De wild-type giststam W303 (leu2-3, 112 trp1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) is getransformeerd met een hoog kopie (2μ) plasmide DNA dat ons gen van belang (ENTH2) bevat onder de controle van een methionine-repressible promotor (MET25). 2 mM methionine is voldoende om promotor activiteit te onderdrukken, terwijl de media ontbreekt methionine laat maximale expressie. Daarom kan een reeks van....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft hoe het toezicht op de ontwikkeling van een morfologische fenotype (gistcel niet in staat om een goede celdeling ondergaan) op eiwit overexpressie. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om gistcellen oogst pelletering bij de aanbevolen centrifugeersnelheid als hogere snelheden kunnen beschadigen cellen en obscure resultaten. Methyleenblauw en Calcofluor wit moet worden toegevoegd aan cellen leven vlak voor beeldvorming zoals ze zijn giftig. Deze procedure kan ook gem.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Brian G. Coon en Claudia B. Hanna voor nuttige discussies en ondersteuning. Dit project werd ondersteund door start-up middelen van de Dep. van Biologische Wetenschappen, Purdue University aan R. Claudio Aguilar en een American Cancer Society Institutioneel Onderzoek Subsidie aan R. Claudio Aguilar door de Purdue Cancer Center.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
Gietz, R. D., Woods, R. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

In This Article

Summary

Abstract

Protocol

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles