Immunocytochemische analyse van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een Self-Made Cytospin Apparatuur

Samenvatting

Opschorting immunocytochemische kleuring van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) voor het celoppervlak markers (SSEA-3/SSEA-4) werd bereikt op basis van het gebruik van een zelfgemaakte Cytospin apparaat tot een monolaag van cellen voor observatie en kwantificering te creëren.

Samenvatting

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) dat de menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) omvatten zijn spannende cel bronnen door hun grenzeloze zelfvernieuwing mogelijkheden en hun potentieel om te differentiëren in verschillende celtypes. De pluripotente toestand van hPSCs wordt meestal bepaald door technieken zoals qPCR, immunocytochemie, en door andere

Protocol

Deel 1: Vering immunocytochemische kleuringsprocedure

1. Cellen worden geoogst in een enkele celsuspensie.
2. De cellen worden vervolgens overgebracht naar 1.5-2 ml microcentrifugebuizen en gecentrifugeerd bij 200g gedurende 4 minuten.
3. Cellen worden gewassen door opzuigen uit supernatant, opnieuw gesuspendeerd in 1 ml PBS - (zonder Mg ^{2 +} en Ca ^{2 +)} en dan weer gecentrifugeerd bij 200g gedurende 4 minuten. Dit moet twee keer worden gedaan.
4. Na het wassen, worden de cellen vervolgens opgelost met een nieuwe schorsing ze in 1 ml van 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
5. Cellen worden weer twee keer gewassen met 1 ml PBS -.
6. Na het wassen, blok cellen door re-schorsing ze in 1 ml van Block Solution (6% serum/94% PBS -). Incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
7. Na, centrifuge buizen op 200g voor 4 minuten en zuig uit Block Solution. Re-schorten cellen in 1 ml van het primaire antilichaam-oplossing (gemaakt met Block Solution in de aanbevolen verdunning). Cellen kunnen worden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C gedurende de nacht voordat u verder gaat met de volgende stap.
8. Cellen worden vervolgens tweemaal gewassen met 1 ml van Blok Solution.
9. Na opnieuw te schorten cellen in 1 ml van secundair antilichaam-oplossing (gemaakt met Block Solution in de aanbevolen verdunning) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
10. Na 1 uur, moeten cellen vervolgens tweemaal opnieuw worden gewassen met 1 ml van Blok Solution.
11. Na het wassen met Block Solution, opnieuw wassen cellen met 1 ml PBS -.
12. Na de verschillende gewassen, opnieuw te schorten cellen in 1 ml van DAPI nucleaire vlek (1:10.000 verdunning van DAPI in PBS -) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
13. Na 5 minuten, centrifugebuis bij 200g gedurende 4 minuten. Aspireren de DAPI nucleaire vlek oplossing en resuspendeer cellen in 1 ml PBS -.

Deel 2: Integratie van hPSCs in dia's gegenereerd door Cytospin apparatuur

1. Plastic dia's worden voorbereid door het maken van de gewenste hoeveelheid van gaten in hen met een boor pers. De diameter moet in de meeste 1mm groter is dan de grootste diameter van de micropipet tip (s) worden gebruikt.
2. Filtreerpapier wordt gesneden om de parameters van de kunststof glijbaan met een schaar.
3. Gaten worden vervolgens in het filtreerpapier. De grootte van het gat (s) moet groot genoeg zijn dat de micropipet tip (s) snuggly past doorheen.
4. Na, een van de bereide plastic dia's is bovenaan geplaatst en een glazen schuif geplaatst op de bodem van de cut filter papier (figuur 1). De lagen worden vastgezet met tape.
5. Een maximum van 100μL (afhankelijk van de gewenste monolaag dichtheid) van de gebrandschilderde celsuspensie uit deel 1 wordt dan geplaatst in de top van de micropipet tip (s).
6. Indien nodig kan het apparaat met een mobiele oplossing worden afgewogen en een tegenwicht van vergelijkbaar gewicht zijn gecreëerd.
7. De Cytospin apparaat en contra-evenwicht kan worden dan geplaatst in een desktop-centrifuge en gecentrifugeerd bij 200g gedurende 4 minuten.
8. Na het centrifugeren, is het Cytospin apparaat zorgvuldig uit elkaar gehaald op een manier die doesnt los van de cellen van het glaasje.
9. Indien nodig, teveel omringende PBS - op glas kant in geaspireerde uit.
10. Cellen kunnen vervolgens bekeken worden met behulp van een fluorescentie microscoop om te controleren of de gewenste cel monolaag is bereikt.

Deel 3: Montage dia's

1. Een druppel van de gewenste montage media is direct geplaatst in het midden van elk gebied met cellen.
2. Na, is een dekglas voorzichtig zakken op de dia's proberen om luchtbellen te vermijden indien mogelijk.
3. Overtollige montage media wordt vervolgens verwijderd uit dia's.
4. Na, zijn de zijkanten van de dekglaasjes verzegeld met nagellak.
5. De dia's kunnen worden bewaard in een donkere opslagruimte totdat de resultaten worden waargenomen en gedocumenteerd.

Discussie

Voor de toepassing van ons lab, is een 35mm gerecht van stamcellen culturen gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) toegewezen voor de immunocytochemische kleuring procedure voor gebruik met de Cytospin apparaat. De cellen worden vervolgens verzameld door middel van enzymatische passage, het verwijderen van zoveel mogelijk van de MEF laag als mogelijk, in een single-celsuspensie. Als er meer effectiever stamcellen isolatie van de MEF laag gewenst is, kan kolonies dan handmatig worden opgehaald verteerd in suspens...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Materiaal voor herbruikbare plastic slides
Superfrost/Plus Microscoopglaasjes Voorgereinigd	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filtertips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscoopdekglas	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Montagemedium
DPBS	GIBCO, van Life Technologies	14190
Normaal Geitenserum	Invitrogen	10000C
Muis Anti-SSEA-4 Monoklonaal Antilichaam	EMD Millipore	MAB4304	Primair Antilichaam voor SSEA-4 kleuring
Ratten Anti-SSEA-3 Monoklonaal Antilichaam	EMD Millipore	MAB4303	Primair Antilichaam voor SSEA-3 kleuring
Alexa Fluor 488 Geit Anti-Muis IgG	Invitrogen	A11029	Secundair Antilichaam voor SSEA-4 kleuring
Alexa Fluor 488 Gelabeld Geit Anti-Ratten IgG	Invitrogen	A11006	Secundair Antilichaam voor SSEA-3 kleuring
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298