Methodenartikel

Chronisch Salmonella Infected Muis Model

DOI:

10.3791/1947

⸱

31 mei 2010

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Rochester

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stel een chronische bacteriële infectie muismodel met persisterende Salmonella Typhimurium kolonisatie in de darm voor 27 weken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bacteriële infectie muis model is een krachtig modelsysteem voor de bestudering van gebieden, zoals infecties, ontstekingen, immunologie, signaaltransductie, en tumorigenese. Veel onderzoekers hebben gebruik gemaakt van de colitis veroorzaakt door

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol omvat drie delen: bacteriecultuur, muis maagsonde, en Salmonella detectie.

1. Salmonella groei conditie.

  1. Bereid de Salmonella Luria-Bertani bouillon (LB) Plaat uit, incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.
  2. Kies een kloon van de LB plaat en in 7 ml LB in een 12 ml tube, en schud bij 37 ° C gedurende ongeveer 5 uur.
  3. Inoculeren 50 ml LB met 0,05 ml van een stationaire fase cultuur en incubeer bij 37 ° C zonder schudden gedurende ongeveer 18 uur.
  4. Spin 's nachts bacteriecultuur bij kamertemperatuur met 6000 rpm gedurende 10 minuten, schorten de bacteriën in HBSS met behulp verhouding 100:3 (LB: HBSS). Bijvoorbeeld:
    Elke 50 ml LB cultuur worden gesuspendeerd in 1,5 ml HBSS.
  5. Voor het dier maagsonde, verder te verdunnen de bacteriecultuur op 01:10-verhouding. Bijvoorbeeld:
    Elke 1,5 ml LB cultuur worden gesuspendeerd in 15 ml HBSS.

2. Salmonella-infectie model *.

  1. Bereid de streptomycine oplossing. Elke muis krijgt 7,5 mg streptomycine in 100 pi HBSS. Bijvoorbeeld, voor te bereiden in totaal 90 mg streptomycine in 1,2 ml HBSS voor 10 muizen. Altijd wat extra volume bij het opstellen van het streptomycine oplossing.
  2. Te trekken water en voedsel 4 uur voor orale sondevoeding behandeling.
  3. Maagsonde muizen met streptomycine met 7,5 mg van streptomycine (100 ul van HBSS voor controle muizen). Pak de huid over de muis schouder stevig met de duim en middelvinger, rek het hoofd en de hals met de wijsvinger naar de slokdarm straight te maken. Richt de bal-tip van de voeding naald langs het dak van de mond en in de richting van de rechterzijde van de achterkant van de keelholte, vervolgens voorzichtig naar beneden gaan in de slokdarm en injecteer de 100 pi oplossing. Geen weerstand zou moeten worden gevoeld.
  4. Op 20 uur na de behandeling streptomycine, teruggetrokken water en voedsel weer voordat de muizen besmet zijn met bacteriën.
  5. Maagsonde elke muis met 100 ul schorsing in HBSS of behandeld met steriele HBSS (controle) door orale sondevoeding. De maagsonde procedure is hetzelfde als 2.3) maagsonde muizen met streptomycine.

* Dierproeven werden uitgevoerd door het gebruik van specifieke-pathogeen-vrije vrouwelijke C57BL / 6 muizen (Taconic, Hudson, NY) die 6-7 weken oud zijn als eerder beschreven 1. Het protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Rochester University Comite voor de Resources (UCAR).

3. Detectie van Salmonella in de darmen.

  1. Verzamel muis fecale (ongeveer 100 mg).
  2. Overdracht fecale monster tot een 1,5 micro-centrifugebuis met 1 ml PBS en vortex krachtig.
  3. Centrifugeer gedurende 10 min bij 800 rpm. Breng de bovenstaande in een schone microfugebuis.
  4. Centrifugeren bij 6000 rpm voor 5min. Supernatans verwijderd en 200 pi PBS wordt toegevoegd aan de pellets en gevortexed.
  5. Streak de 200 ul PBS met een wegwerp cel spreader op een BBL CHROMagar plaat om Salmonella te detecteren. Salmonella species verschijnen mauve (steeg tot paars, zie figuur 1). Als 200 ul levert te veel kolonies op de plaat, gebruikt 100 ul of 50 ul voor de streep.

4. Representatieve resultaten.

Wanneer het protocol goed wordt gedaan, kan Salmonella typhimurium kolonisatie worden gedetecteerd in de muis darm meer dan 6 maanden. Salmonella kan worden gedetecteerd door fecale cultuur meer dan 6 maanden (Fig.1). Als een typische komen van dit model, body weegt verlies en dood binnen 4 weken na infectie. Afhankelijk van de Salmonella-stammen gebruikt voor infectie, kunnen sommige muizen geen overleven meer dan 6 maanden.

figure-protocol-1
Figuur 1. Intestinale Salmonella in de Salmonella species verschijnen mauve (roze tot paars) in kleur, als gevolg van metabole verschillen in de aanwezigheid van de gekozen chromogenen. Andere bacteriën zijn ofwel geblokkeerd of produceren blauw-groen of kleurloze kolonies.

figure-protocol-2
Figuur 2. Survival proporties van muizen die besmet zijn met Salmonella mutante stam PhoP c, c PhoP Avra-, en PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra gedurende 4 weken (28 dagen).

Tabel 1. Lichaamsgewicht van muizen die besmet zijn met Salmonella gedurende 4 weken.

0 1 week 2 weken 3 weken 4 week
controle 16.78 ± 1.05 16.91 ± 1.28 18.26 ± 1.23 19.31 ± 1.26 20.26 ± 1.15
PhoP c 16.89 ± 1.03 17.14 ± 1.19 17,43 ± 1,63 * 18.68 ± 1.78 20.05 ± 1.11
PhoP c Avra- 16.91 ± 1.12 16.96 ± 1.39 17,06 ± 2,14 ** 18.71 ± 2.18 20.15 ± 1.56
PhoP c AvrA-/AvrA + 16.94 ± 0.96 17.17 ± 1.02 17,63 ± 1,42 * 18.44 ± 2.03 20.09 ± 1.17

* In vergelijking met de controlegroep p <0,05
** Ten opzichte van de groep p <0,01 controle

Tabel 2. Salmonella-stammen die in deze studie.

Naam Beschrijving Referentie of bron
Salmonella 14028s Wild-type S. typhimurium ATCC
PhoP c Niet-pathogene complex regulator mutant Miller et al.., 1990
PhoP c Avra- Avra-mutatie Collier-Hyams et al.., 2002
PhoP c AvrA-/AvrA + PhoP c Avra-met aangevuld plasmide coderend voor Avra Collier-Hyams et al.., 2002

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het gebruik van dit systeem, is het noodzakelijk dat de onderzoeker om te leren hoe de dieren maagsonde. We detail een methodiek voor te bereiden bacteriecultuur en maagsonde de muizen. We hebben ook laten zien hoe je de Salmonella persistentie in de gastro-intestinale (GI) stelsel te controleren. De kritische stappen in dit protocol, waaronder:

  1. Streptomycine-voorbehandeling: streptomycine-voorbehandeling kan ontdoen van een aantal commensale darmflora en maken de muizen gevoelig zijn voor de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de NIDDK KO1 DK075386 te verlenen en de American Cancer Society RSG-09-075-01-MBC tot Jun zon

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HBSSSigma-AldrichABCD1234
Luria-Bertani bouillonBD Biosciences244610
VoedingsnaaldPopper & Sons, Inc.7920
StreptomycineMP Biomedicals100556
BBL CHROMagar SalmonellaBD Biosciences214983
WegwerpcelspreidersBiologix Research Company65-1010

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
  2. Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
  3. Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
  4. Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
  5. Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
  6. Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
  7. Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
  8. Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
  9. Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
  10. Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
  11. Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
  12. Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
  13. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
  14. Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chronische Salmonella infectieprocedure voor sondevoeding bij muizenanalyse van ontlastingSalmonella detectievoorbehandeling met streptomycineintestinale kolonisatiemonitoring van het lichaamsgewichtimmunofluorescentiekleuringSalmonella persistentie

Gerelateerde artikelen