Dit artikel illustreert hoe goed gebruik van de BioRad Helios Gene Gun om plasmide DNA te introduceren in ui epidermale cellen en hoe om te testen voor eiwit-eiwit interacties in ui cellen op basis van het principe van de Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC)
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onderzoek naar gen-functie in diverse organismen is gebaseerd op kennis van hoe de genproducten met elkaar in hun normale cellulaire omgeving. De Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Assay
Protocol
I. Plasmide voorbereiding
Het plasmide DNA wordt gebruikt voor het bombardement moet zijn van de hoge zuiverheid en bij een concentratie van 500ng/μl of hoger. Voor BiFC waarbij twee plasmide constructen, is 25 ug van elk plasmide nodig. Met andere woorden, 01:01 molaire verhouding van de twee plasmiden worden gemengd om aanleiding te geven tot 50 ug totaal plasmide DNA voor de bereiding van cartridges. Wees ervan bewust dat het toevoegen van meer dan 50 ug DNA kan agglomeratie van de gouddeeltjes oorzaak en moet worden vermeden. In de handel verkrijgbare plasmide DNA-extractie kits worden aanbevolen voor het isoleren van plasmide DNA.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
- Voor het eerst gebruikt, raden we aan het oefenen van de gehele procedure, van de cartridge voorbereiding tot observatie, met een enkel plasmide constitutief reporter, zoals 35S:: GFP of 35S:: GUS. Wij gebruikten een 35S:: GFP plasmide verkregen van Drs. Steve Mount en Xiaoning Zhang 6 (figuur 1A, D). Het gen schot controle cartridges verkocht tegen RioRad (Cat 165-2244) zijn niet geschikt voor planten.
- Voor BiFC, een tweede positieve controle noodzakelijk is, die moet bestaan uit twee bekende interagerende partn.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken Drs. Steve Mount en Xiaoning Zhang voor de 35S:: GFP pGlowbug bouwen en de Hokensen Doctoral Fellowship aan CH Onderzoek in het laboratorium Z. L's wordt ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (IOB0616096 en MCB0744752). ZL wordt gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Maryland Agricultural Experiment Station.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Gele ui | Alle leveranciers | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescentiemicroscoop met passende filters voor GFP of YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
Referenties
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
