Method Article

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun

DOI:

10.3791/1963

⸱

June 12th, 2010

 , 
1Dept. Of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel illustreert hoe goed gebruik van de BioRad Helios Gene Gun om plasmide DNA te introduceren in ui epidermale cellen en hoe om te testen voor eiwit-eiwit interacties in ui cellen op basis van het principe van de Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC)

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek naar gen-functie in diverse organismen is gebaseerd op kennis van hoe de genproducten met elkaar in hun normale cellulaire omgeving. De Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Assay

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. Plasmide voorbereiding

Het plasmide DNA wordt gebruikt voor het bombardement moet zijn van de hoge zuiverheid en bij een concentratie van 500ng/μl of hoger. Voor BiFC waarbij twee plasmide constructen, is 25 ug van elk plasmide nodig. Met andere woorden, 01:01 molaire verhouding van de twee plasmiden worden gemengd om aanleiding te geven tot 50 ug totaal plasmide DNA voor de bereiding van cartridges. Wees ervan bewust dat het toevoegen van meer dan 50 ug DNA kan agglomeratie van de gouddeeltjes oorzaak en moet worden vermeden. In de handel verkrijgbare plasmide DNA-extractie kits worden aanbevolen voor het isoleren van plasmide DNA.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Voor het eerst gebruikt, raden we aan het oefenen van de gehele procedure, van de cartridge voorbereiding tot observatie, met een enkel plasmide constitutief reporter, zoals 35S:: GFP of 35S:: GUS. Wij gebruikten een 35S:: GFP plasmide verkregen van Drs. Steve Mount en Xiaoning Zhang 6 (figuur 1A, D). Het gen schot controle cartridges verkocht tegen RioRad (Cat 165-2244) zijn niet geschikt voor planten.
  2. Voor BiFC, een tweede positieve controle noodzakelijk is, die moet bestaan ​​uit twee bekende interagerende partn.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Drs. Steve Mount en Xiaoning Zhang voor de 35S:: GFP pGlowbug bouwen en de Hokensen Doctoral Fellowship aan CH Onderzoek in het laboratorium Z. L's wordt ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (IOB0616096 en MCB0744752). ZL wordt gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Maryland Agricultural Experiment Station.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Yellow onionAny Supplier
Helios Gene GunBio-Rad
Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFPZeiss, Nikon, Olympus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
  2. Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bimolecular Fluorescence ComplementationProtein Protein InteractionOnion Epidermal CellsHelios Gene GunFluorescence MicroscopyPlasmid BombardmentGold Particle CoatingSEU LUH InteractionYFP Fluorescence DetectionNegative Control Assay

Related Articles