Het volgende protocol schetst het proces van het pancreas dissectie voor virtuele slice beeldvorming, en de daaropvolgende kwantificering van alle GFP-gelabelde beta-cellen in de gehele alvleesklier.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In situ kwantificering van beta-celmassa in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Traceren veranderingen van specifieke cel populaties in gezondheid en ziekte is een belangrijk doel van het biomedisch onderzoek. Het proces van de controle pancreatische beta-cel-proliferatie en eilandje groei vormt een bijzondere uitdaging. We hebben een methode ontwikkeld om de distributie van beta-cellen vast te leggen in het intacte pancreas van transgene muizen met fluorescentie-gelabeld beta-cellen met een macro geschreven voor ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Na de pancreas dissectie en weefsel clearing wordt de hele alvleesklier vastgelegd als een virtuele slice, waarna de GFP-gelabelde beta-cellen worden onderzocht. De analyse omvat de kwantificering van de totale bèta-cel gebied, eilandje aantal en de grootte distributie met verwijzing naar specifieke parameters en locaties voor elk eilandje en voor kleine clusters van beta-cellen. De gehele verdeling van de eilandjes kunnen worden uitgezet in drie dimensies, en de informatie van de distributie op de grootte en vorm van elk eilandje staat een kwantitatieve en kwalitatieve vergelijking van de veranderingen in de totale beta-cel gebied in een oogopslag.
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van Monsters
- Plaats een muis onder een dissectie microscoop, verwijder dan de hele alvleesklier, samen met de twaalfvingerige darm en de milt nog steeds verbonden, en plaats de organen op een vooraf gewogen glasplaatje. Verwijder de twaalfvingerige darm door te snijden zijn bindweefsel langs de kant waar het wordt gebonden aan de alvleesklier. Knippen en verwijder de milt en overtollige vet op de alvleesklier tot de alvleesklier is volledig geïsoleerd op de dia. (Pancreas vet is te onderscheiden door de witte kleur, als onderscheiden van de iets donkerder en leerlooier kleur van de pancreas weefsel.)
- Plaats een dekglaasje (g....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De analyse van Virtual Slice beelden van eilandjes en beta-cel clusters in de intacte alvleesklier zorgt voor een grote weergave van de gehele verdeling van de eilandjes. Ontwikkelingen en veranderingen in het totaal eilandje verdeling over de tijd kan dus worden bestudeerd en vergeleken. Zo'n voorbeeld wordt gedemonstreerd in onze analyse van de eilandjes van Langerhans formatie (1). Een uitgebreide analyse van neonatale muizen pancreata op verschillende tijdstippen (P1-P21) heeft aangetoond dat eilandjes worden gevorm.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De studie wordt ondersteund door US Public Health Service Grant DK-081527, DK-072473 en DK-20595 aan de Universiteit van Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal Models Core), en een geschenk van de Kovler Family Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Pincet | Miltex Inc. | ||
| Schaar | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Schaar | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Groot objectglas | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Groot dekglas | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Objectglas | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Dekglas | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Dekglas | Erie Scientific | 25mm cirkel | |
| Fluorescentiemicroscoop | Olympus Corporation | ||
| Dissectiemicroscoop | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP muizen | Jackson Laboratory |
Referenties
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
