De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege gewervelde embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. In de zebravis embryo's, injectie van plasmide DNA resulteert in een mozaïek expressie, waardoor voor de visualisatie van losse cellen of kleine clusters van cellen
Protocol
1.Microinjection
- Verdunnen plasmide coderend voor membraan-gerichte Green Fluorescent Protein (mGFP, met dank aan Richard Harland) tot een concentratie van 40 ng / ml. DNA wordt bereid door lineariseringsschakelingen plasmide (mGFP/PCS2 +, met dank aan Richard Harland) gezuiverd met behulp van de Qiagen Maxi Prep Kit. Toevoeging van fenol rood (1 / 10 verdund totaal volume) aan de oplossing heeft de voorkeur om de oplossing te visualiseren. Houden DNA-oplossing op het ijs.
- Onder een stereomicroscoop, kalibreren van de injectienaald (90mm glas capillairen van Narishinge Scientific; Cat No NA-GD-1) door aanpassing van de naald op een afgestudeerd g....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kortom, de etikettering hier beschreven technieken zorgen voor enkele cel analyse van morfogenetische processen in de zebravis embryo. De primaire nadruk van dit protocol is over de methoden voor de beeldvorming gelabelde cellen in de neurale buis met behulp van mGFP onder de controle van een alomtegenwoordige promotor. Voor extra toepassingen van deze transiënte expressie test lezers worden verwezen naar een recent artikel van Andersen et al.. 3.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een NIH subsidie toegekend aan R. Brewster (1R01GM085290-01A1).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
Oplossingen
- Hank's Stock # 1: 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl in 100 ml dd H 2 O
- Hank's Stock # 2: 0,358 g Na 2 HPO 4 watervrij, 0,60 g KH 2 PO 4 in 100 ml DDH 2 O
- Hank's Stock # 4: 0,72 g CaCl 2 in 50 ml DDH 2 O
- Hank's Stock # 5: 1,23 g MgSO 4 x7H 2 O in 50 ml dd H 2 O
- 1 X fosfaatbuffer: 0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,02 M PO4, pH 7,3
- Het blokkeren Oplossing: 2% normaal geit serum, 1% bovine serum albumine (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
Referenties
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain
Posted by JoVE Editors on 9/16/2010. Citeable Link.
A correction was made to Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1
1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County
2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2
1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
