Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

Summary

In deze video laten we zien efficiënte electrofusie van cellen In vitro Door middel van aangepaste naleving methode met behulp van elektroporatie en de daaropvolgende detectie van gefuseerde cellen visualisatie met fluorescentie microscopie.

Abstract

Cel elektrolasverbinding is een veilige, niet-virale en niet-chemische methode die kan worden gebruikt voor het bereiden hybride cellen voor de menselijke therapie. Electrofusie gaat om de toepassing van korte high-voltage elektrische pulsen om cellen die in nauw contact. Toepassing van de korte, hoge-voltage elektrische pulsen veroorzaakt destabilisatie van de cel plasma membranen. Gedestabiliseerd membranen zijn meer doorlaatbaar voor verschillende moleculen en ook gevoelig voor fusie met naburige gedestabiliseerd membranen. Elektrolassen is dus een handige methode om een ​​niet-specifieke fusie van zeer verschillende cellen te bereiken

Protocol

I. Het laden van de cellen met Cell trackers CMFDA en CMRA

1. Experimenten werden uitgevoerd op vooraf bereide cellen van muizen melanoom cellijn (B16-F1). Cellen worden gekweekt in twee gescheiden 25 cm ² cultuur flessen (TPP, ZDA) tot 70-80% confluentie in DMEM kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 0,15 mg / ml L-glutamine, 16 mg / ml gentamicine (alle van Sigma-Aldrich, Duitsland), 200 eenheden / ml crystacillin (Pliva, Kroatië), en geïncubeerd in 5% CO ₂ bij 37 ° C.
2. Bereid twee 10 mM voorraad oplossingen van Cell trackers (Invitrogen, USA) door het toevoegen van 10,76 pl en 9 ul (voor Groen CMFDA en voor Orange CMRA, respectievelijk) van DMSO (Sigma-Aldrich, Duitsland) tot 50 ug van de kleurstof in de oorspronkelijke Invitrogen flacon. De voorraad-oplossing kan worden opgeslagen in een koelkast bij 4 ° C voor enkele maanden. Voordat u begint met de experimenten, warming-up van de oplossing tot de kristallen van DMSO op te lossen.
3. Bereid bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 11,7 mM D-glucose, 1,3 mM _CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4). In twee 15 ml Eppendorf-buisjes apart mix 2,1 pi van elk bestand oplossing (10 mM CMFDA of CMRA, respectievelijk) in 3 ml bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer. Dit levert een "laad-oplossing" met ongeveer 7 uM CMFDA (of CMRA).
4. Twee keer Spoel cellen met bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer en steek laad-en lossystemen in de kolven. Incubeer cellen gedurende 30 minuten in 5% CO ₂ bij 37 ° C. Tijdens deze eerste incubatie reagentia passeren vrij door celmembranen, maar eenmaal binnen de cel, worden de reagentia omgezet in cell-impermeant fluorescerende reactieproducten.
5. Na de eerste incubatie, spoelen en cellen met voedingsbodem voor nog eens twee uur in 5% CO ₂ incuberen bij 37 ° C.
6. Trypsinize cellen in beide kolven (geladen met CMFDA en CMRA) en mengen rode en groene cellen in een verhouding 1:1 in een centrifugebuis van 50 ml (TPP, ZDA). Stel cel concentratie 5 x 10 ⁶ cellen / ml door verdunning met DMEM medium of door concentratie met centrifuge. Plaats een 20 pl druppel celsuspensie in elk putje van 24 multiwell plaat (TPP, ZDA). Incubeer cellen in 5% CO ₂ bij 37 ° C gedurende 20 minuten, zodat ze iets hechten aan het oppervlak van de put en cel contacten te leggen.

II. Elektrolassen

1. Bereid isoosomolar kaliumfosfaatbuffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K ₂ HPO _4, 1 mM _MgCl2, 250 mM sucrose) en hypoosmolar kaliumfosfaat buffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K ₂ HPO _4, 1 mM _MgCl2, 75 mM sucrose) .
2. Plaats de meerdere venstertjes met cellen op de microscoop podium, plaatst de elektroden op de bodem van de put en sluit ze aan op de pulsgenerator.
3. Was de cellen met 1 ml van isoosomolar kaliumfosfaat buffer. Voeg 350 ul van hypoosmolar kaliumfosfaat buffer om de cel zwelling induceren. De buffer moet betrekking hebben op de elektroden.
4. Laat cellen in hypoosmolar buffer gedurende 2 minuten voor het aanbrengen van elektrische pulsen. Gedurende deze tijd toevloed van water moleculen in de cellen als gevolg van osmotische evenwicht tussen de binnenkant en de buitenkant van de cellen veroorzaken een toename van cell volume. Elektrische pulsen moeten worden toegepast wanneer de cellen dicht bij hun maximale volumes, voordat de regelgeving volume te verlagen starten.
5. Om een ​​optimale electrofusie bereiken en te handhaven levensvatbaarheid van de cellen zijn, moeten optimale parameters van elektrische pulsen worden gebruikt. Deze zijn afhankelijk van cellijn gebruikt [1]. In dit experiment een trein van 8 rechthoekige pulsen (elk met een duur van 100 microseconden bij 1 Hz) wordt toegepast op elk monster, met behulp van elektroporatie apparaat (in ons geval Cliniporator, IGEA, Italië). De pulsen worden geleverd aan twee parallelle Pt / Ir draadelektroden met 0,8 mm diameter en 5 mm afstand tussen hen, het creëren van een elektrisch veld van ongeveer 1200 V / cm tussen de elektroden in elk putje, behalve voor de controle goed.
6. Laat de cellen ongestoord gedurende 10 minuten na de puls levering. Bepaal de fusie opbrengst door middel van TL-en fase-contrast microscopie.

III. Beeldacquisitie en bepaling van de fusie opbrengst

1. De cellen worden waargenomen met behulp van een fluorescentie microscoop (in ons geval Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Duitsland) zijn uitgerust met een objectief (x20) en een gekoelde CCD-camera (VisiCam 1280, Visitron, Duitsland). De beelden worden verkregen in Metamorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), maar ook andere soortgelijke acquisitie software kan ook worden gebruikt. CMFDA is opgewekt met een monochromator (Polychrome IV, Visitron, Duitsland) bij 492 nm en 548 nm CMRA op. De fluorescentie van CMFDA en CMRA wordt verkregen met behulp van twee emissie-filters, een gecentreerd op 535 nm (HQ535/30m voor CMFDA) en de andere gecentreerd op 510 nm (D605/55m, voor CMRA, beide Chroma, USA). Het gebruik van dichroïsche spiegel (Q515LP) voorkomen dat het kanaal overspraak.
2. Acquire drie foto's (fase contrast, rode en groene fluorescentie) voor vijf willekeurig gekozen velden in elk putje. Maak drie kanalen beelden van elke afbeelding triplet. In een dergelijke afbeelding fluorescerende cytoplasma kunnen samen gezien worden met de celmembranen. Gefuseerde cellen kan dus eenvoudig worden bepaald [Figuur 1].
3. Tellen alle drie de typen cellen (rood, groen en duaal TL) in elk drie kanalen beeld. Bepaal het percentage van de tweevoudig fluorescerende cellen door het aantal van de tweevoudig fluorescerende cellen met het aantal van alle cellen in elk beeld. Fusion opbrengst is gedefinieerd als het percentage van de tweevoudig fluorescerende cellen vermenigvuldigd met twee, omdat de helft van de gefuseerde cellen worden niet gedetecteerd (als cellen van dezelfde kleur zekering).

Representatieve resultaten

Figuur 1 Drie kanaal microscopie beeld van B16F1 cellen na elektrolas:. Fase contrast, CMRA fluorescentie (excitatie bij 548 nm) en CMFDA fluorescentie (excitatie bij 492 nm), objectieve vergroting 20x

Discussion

Het vermogen van celmembranen voor niet specifiek, bijvoorbeeld door externe elektrische velden, zekering is van belang voor de biotechnologie, geneeskunde en het onderzoek in de biologie. Dergelijke niet-specifieke fusie maakt de productie van zeer waardevolle hybride cellen en hun producten, zoals monoklonale antilichamen, en geeft informatie over de fundamentele mechanismen van fusie-[2]. Elektrolassen is een potentieel zeer effectieve methode, omdat het goed kan worden aangepast aan verschillende soorten cellen. Elektrolassen wordt bereikt wanneer de cellen in nauw lichamelijk contact worden gebracht in hun fusogenic staat (gevoelig voor fusie) door middel van hoogspanning elektrische pulsen. De efficiëntie van elektrolasmoffen hangt af van verschillende parameters die twee delen van de elektrolas proces beïnvloeden. Eerste deel van de elektrolasapparaat proces is het bereiken van de nauw lichamelijk contact tussen de cellen, die kunnen worden verkregen met verschillende methoden [3-8]. Adherence methode (groeiende cellen tot confluentie) kunnen efficiënt als gevolg van spontaan gevestigde cel contacten in de grote zones tussen de cellen worden gebruikt, maar het produceert zeer grote gefuseerde cellen met veel kernen. Wij maken gebruik van de gemodificeerde hechting methode, waar kleinere cellen (met 2 tot 5 kernen), die hebben meer kans om te overleven en zich vermenigvuldigen, worden verkregen (figuur 1). Contact tussen de cellen ook profiteren van osmotische zwelling van cellen, als gevolg van osmotische behandeling gebruikt in het experiment [9]. Tweede deel van het elektrolasapparaat proces is de verwezenlijking van de fusogenic toestand van de celmembranen. Fusogenic toestand correleert goed met electropermeabilized toestand van het membraan (cellen zijn niet-specifiek gepermeabiliseerde voor moleculen die normaal gesproken niet kan passeren intact membraan) en wordt beheerst door dezelfde parameters van de elektrische pulsen (amplitude, lengte, aantal en frequentie) [10] . De waarden van de elektrische parameters die nodig zijn voor een optimale elektroporatie [1] en elektrolassen verschillen tussen de verschillende cellen en zijn afhankelijk van cellen grootte en hun biologische eigenschappen. Elektrische parameters moeten dus worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen, die worden gebruikt als fusiepartners, om fusie te verkrijgen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMRA	Reagent	Invitrogen	C34551	Cytosolic fluorescent dye
CMFDA	Reagent	Invitrogen	C7025	Cytosolic fluorescent dye
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	Reagent	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum	Reagent	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Reagent	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Reagent	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Hepes	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	Reagent	Merck & Co., Inc.	A124873 927
KH2PO4	Reagent	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	Reagent	Fluka	71382
KCl	Reagent	Merck & Co., Inc.	A154336 908
MgSO4	Reagent	Sigma-Aldrich	M2643
D-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	C4901
sucrose	Reagent	Sigma-Aldrich	16104
Electric pulse generator	Tool	IGEA		Cliniporator VITAE
Multiwell plate	Tool	Techno Plastic Products	92424
50 ml centrifuge tube	Tool	Techno Plastic Products	91050
15 ml centrifuge tube	Tool	Techno Plastic Products	91015
25 cm2 culture flask	Tool	Techno Plastic Products	90026
Electrodes	Tool	Custom Made		Pt/Ir