Dit protocol is een fragment uit Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
1. Bereiding van larven
- Zet twee of meer dagen voor aanvang van de test kruisen van de gewenste experimentele en controlecombinaties (minimaal 20 vrouwtjes en 10 mannetjes elk) in eierschaaltjes zoals beschreven door Wieschaus en Nusslein-Volhard, maar gebruik 50 ml polypropyleen beakers en 6,0 cm wegwerp Petrischalen met druivenagar en besmeurd met gistpasta vlak voor gebruik. Houd vliegen in eierleggende gerechten in het donker bij kamertemperatuur tot het nodig is.
- Druivenagar recept – combineer 100 ml bevroren 100% druivensapconcentraat, 350 ml gedeioiniseerd water, 5 ml ijsazijn en 13 g D. melanogaster agar in een 1L glazen bekerglas. Magnetron in 1-2 minuten barsten, roeren tussen uitbarstingen, totdat agar is allemaal opgelost. Koel de oplossing een paar minuten af en voeg vervolgens 10 ml 10% (m/v) Nipagen (methyl-p-hydroxybenzoaat) toe aan 95% ethanol. Meng, pipetteer vervolgens 7 ml per bord in wegwerp petrischalen van 6,0 cm, laat geleren en drogen op kamertemperatuur gedurende 3-4 uur. Bewaren bij 4 °C in plastic zakken.
- Gistpasta recept – 7 g gedroogde gist, 10 ml gedeioneerd water, mengen met een spatel tot uniforme consistentie.
- Getijde eicollecties om experimentele en controlelarven te genereren. Met behulp van nieuwe, met gist besmeurde druivenplaten, verzamel eieren op kamertemperatuur gedurende 4 uur in het donker tijdens de ochtenduren. Verwijder deze 4 uur verzamelplaten en vervang ze door verse platen. Incubeer de 4 uur verzamelplaten 's nachts bij 25 °C tot de middag van de volgende dag, wanneer de meeste larven zijn uitgebroed. Verzamel deze eerste instar larven en gebruik ze om het experiment op te zetten.
2. Het opzetten van testplaten
- Voorbereiding van testplaten. Bereid voor een enkele run van de test vijf testplaten voor van elk 10 experimentele larven en vijf platen van 10 controlelarven. Gebruik een kurkboorder van 1,5 cm om een centrale kern van agar van elke plaat te verwijderen en een gat voor het voedsel te maken. Doe gistpasta (0,8 - 0,9 g) in het gat en dep zachtjes met een spatel om een heuvel te maken die het gat vult.
- Agar plaat voorbereiding – combineer 700 ml gedeïoniseerd water met 16 g D. melanogaster agar in een 2L glazen beker en magnetron gedurende 5 minuten. Haal uit de magnetron en roer met een glazen staaf om onopgeloste agar in de oplossing te brengen. Voeg 17,5 ml 10% (m/v) Nipagen toe in 95% ethanol, meng en ga vervolgens door met magnetronverwarming in 30 s bursts gevolgd door roeren, totdat alle agar volledig is opgelost. Koel een minuut of twee af en pipetteer vervolgens 15 ml aliquots in plastic petrischalen van 10 cm. Laat agar geleren, bedek borden met deksels en laat ze een paar uur of 's nachts drogen op kamertemperatuur. Bewaar platen in verzegelde plastic zakken bij 18 °C.
OPMERKING 1: Om de vorming van Nipagen-kristallen op het oppervlak van de platen als gevolg van overmatige uitdroging te voorkomen, gebruikt u platen binnen een paar dagen na bereiding. Indien nodig kunnen kristallen opnieuw worden opgelost door er een paar microliters van 95% alcohol op te laten vallen.
OPMERKING 2: partijen agar kunnen verschillende geleereigenschappen hebben. De droge gelplaten moeten stevig aanvoelen en voldoende veerkrachtig zijn dat een schone, intacte cirkel van agar kan worden verwijderd bij het gebruik van de kurkboorder om het voedselgat te maken (zie hierboven).
- Het opzetten van larven in testplaten. Gebruik mechanische druk om de punt van een plastic microspatula te buigen en dompel de punt in gistpasta om "lijm" te bieden voor het oppakken van larven. Pak de eerste instarlarven individueel op en leg ze op de agarplaat dicht bij de voedselheuvel. Bereid ten minste vijf repliceerplaten van 10 larven voor voor zowel experimentele als controle-genotypen. Eenmaal voltooid, dop en label elke plaat en plaats de platen (dekselzijde naar boven) in een donkere ruimte bij kamertemperatuur (in ons lab is dit 22 °C).
3. Controle testplaten
- Onderzoek dagelijks platen onder een ontleedmicroscoop en registreer het aantal larven bovenop het voedsel of op het agaroppervlak. Let op zichtbare dode of stervende larven. Merk op wanneer, en als, tunneling in het agar substratum wordt gezien als larven bewegen naar derde instar. Noteer data waarop poppen zich beginnen te vormen en noteer eventuele popafwijkingen. Blijf dagelijkse waarnemingen doen totdat alle larven zijn gestorven of verpopt.
- Verwijder de poppen voorzichtig van de plaat met een gebogen plaagnaald en breng ze over op een druivenplank. Ga indien gewenst door met het monitoren van poppen om te bepalen hoeveel eclose als volwassenen.
