Drosophila Larva Imaginal Disc Dissectie: Een methode om de ontwikkeling van Epithelia te observeren

Samenvatting

Bron: Morimoto, K. en Tamori, Y. Inductie en diagnose van tumoren in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J.Vis. Exp. (2017).

Bij het kleuren van Drosophila imaginal schijven, vaak een ruwe dissectie wordt uitgevoerd waar de schijven worden blootgesteld, maar blijven bevestigd aan het lichaam. Eenmaal bevlekt, worden de schijven van belang geïsoleerd en gemonteerd. Het voorbeeldprotocol demonstreert een procedure voor vleugel imaginaire schijfdissectie en montage.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Morimoto and Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. Dissectie van larven

1. Verzamel zwervende derde instarlarven met een houten stok of stompe tang, genotypeer ze door geschikte fluorescerende markers(bijv.EGFP) onder een fluorescentie stereoscopische microscoop en plaats ze in een dissectieschaal met PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing).
2. Was de larven in PBS door ze te pipetten met 2 ml plastic transferpipetten.
3. Knijp het midden van de larve met één tang en scheur het lichaam doormidden met de andere tang.
4. Knijp de mondhaak van de voorste helft met één tang en duw de mond naar het lichaam met de andere tang om het lichaam binnenstebuiten te keren.
5. Verwijder onnodige materialen zoals speekselklieren of vetlichamen met een tang.

2. Fixatie en antilichaamkleuring

1. Breng de ontleedde voorste helft van het larvale lichaam (inclusief fantasievleugelschijven) over in een plastic buis van 1,5 ml en bevestig deze gedurende 10 minuten in 1 ml Fix-oplossing (4% Formaldehyde in PBS) bij kamertemperatuur in het donker met zachte rotatie.
   LET OP: Formaldehyde is giftig en heeft een kankerverwekkend potentieel. Draag beschermende handschoenen en kleding om huidcontact te voorkomen.
   OPMERKING: In dit deel vinden alle stappen plaats op een nutator bij kamertemperatuur in het donker, tenzij anders vermeld.
2. Verwijder de Fix-oplossing en gooi deze weg. Was de weefsels met 1 ml PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) driemaal gedurende elk 15 minuten.
3. Verwijder de PBT en voeg 1 ml PBTG (0,2% runderserumalbumine en 5% normaal geitenserum in PBT) toe voor het blokkeren en noteren van 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
4. Verwijder PBTG en voeg primaire antilichaamoplossing toe die op de juiste manier is verdund met PBTG (zie tabel met materialen)en noteer 's nachts bij 4 °C.
5. Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de weefsels met 1 ml PBT driemaal gedurende elk 15 minuten.
6. Verwijder PBT en voeg secundaire antilichaamoplossing toe die op de juiste manier is verdund met PBTG (1:400). Nutate gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
7. Verwijder secundaire antilichaamoplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende elk 15 minuten.
8. Om F-actine te bevlekken, verwijdert u PBT en voegt u Phalloidine-oplossing toe die op de juiste manier is verdund in PBS (1:40). Dan nutate gedurende 20 min. Verwijder de Phalloidin-oplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende elk 15 minuten.
9. Om nucleair DNA tegen te gaan, verwijdert u PBT en voegt u DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole) oplossing (0,5 μg/ml DAPI in PBS) toe. Dan nutate 10 min.
   LET OP: DAPI heeft een kankerverwekkend potentieel. Draag beschermende handschoenen en kleding om huidcontact te voorkomen.
10. Verwijder de DAPI-oplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende elk 15 minuten.
11. Spoel eenmaal in 1 ml PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
12. Verwijder PBS en voeg 500 μL 100 % glycerol toe als voormontagemedium.

3. Montage op microscoopdia's

1. Plaats de bevlekte weefsels op een microscoopschuif met behulp van een plastic transferpipet van 2 ml.
2. Breng de weefsels over op druppels montagemedium op een andere microscoopschuif met een tang.
3. Houd het uiteinde van ontleed weefsel vast met één tang en trek hersen- en oogantenneschijven weg met de andere tang.
   OPMERKING: Houd de ontleedde hersenen om ze in de buurt van de vleugel fantasieschijven te plaatsen. De hersenen fungeren als een platform dat voorkomt dat de coverslip de fantasieschijven van de vleugel verplettert.
4. Om de vleugel fantasieschijven te isoleren, houdt u het uiteinde van ontleed weefsel vast met één tang en krabt u voorzichtig aan de lichaamswand en scheurt u de schijven af met de andere tang.
   OPMERKING: Als het moeilijk is om vleugel imaginele schijven te vinden, pelt u de luchtpijp van de achterste naar de voorste kant. Vleugel fantasieschijven plakken aan de luchtpijp.
5. Bedek de fantasieschijven voorzichtig met een coverslip en sluit af met nagellak; bewaren bij 4 °C.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap