Dit protocol is een fragment uit Immarigeon et al., A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).
1. Oplossingen en materiaalvoorbereiding
-
Bereid de volgende oplossingen voor.
- Prepare Serum Supplemented Medium (SSM): Schneider's Drosophila medium aangevuld met 10% warmte-inactief foetale runderserum en 1% Penicilline-Streptomycine.
- Bereid aliquots van 1x trypsine-enzym (bijv. TrypLE Express Enzyme) en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid aliquots papaïne [50 U/ml] (bewaard bij -20 °C en slechts één keer ontdooid).
- Bereid 1x fosfaatbufferoplossing (PBS, bewaard bij kamertemperatuur).
-
Bereid meerdere vlamgeronde pipetpunten voor op de fysieke dissociatie van accessoireklieren.
OPMERKING: Gebruik lage retentietips voor het hanteren van accessoireklieren, omdat ze de neiging hebben om zich aan onbehandeld plastic te hechten. Het proces van vlamafronding vermindert de tipopening en maakt de randen van de tip glad. Dit zorgt voor een efficiënte dissociatie na peptidasevertering zonder de celmembranen te scheren.
- Snijd een punt van 200 μL met een scherp mes en steek deze voorzichtig over een vlam om de punt af te ronden, zodat de opening breder maar glad is voor gebruik tijdens stap 2.7.
- Verklein de opening van meerdere 1.000 μL-uiteinden door de tipopening minder dan één seconde in de buurt van een vlam te passeren. Draai de punt iets om oversmelting of verstopping te voorkomen. Sorteer de tips van smaller naar breder. Dit kan worden gedaan door de snelheid van aspiratie te timen. Probeer een kleinschalig monster van AGs te ontkoppelen om de efficiëntie van de smalste tips te testen.
OPMERKING: Deze tips zijn van cruciaal belang voor mechanische agitatie. Hoogwaardige vlamgeronde pipetpunten zorgen voor volledige dissociatie met behoud van de levensvatbaarheid van de cel. Als zodanig worden deze tips aan het einde van de procedure grondig gewassen met water voor hergebruik. Dit maakt dagelijkse reproduceerbare dissociatie mogelijk.
2. Dissectie van accessoire klieren
- Doe 20 tot 25 mannelijke Drosophila in een glazen schaal op ijs.
- Ontleed 1 man in SSM. Verwijder het voortplantingskanaal en verwijder het accessoireklierpaar van alle andere weefsels, afgezien van het ejaculatoire kanaal.
OPMERKING: Verwijder teelballen omdat het vrijgegeven sperma klonten kan creëren en het dissociatieproces kan verstoren. Verwijder de ejaculatoire bol, wat het hanteren moeilijk maakt wanneer deze drijft.
- Breng met een tang accessoirewartels over naar een glazen plaat gevuld met SSM bij kamertemperatuur. Herhaal stap 2.2-2.3 20 keer om een batch van 20 paar klieren in SSM te verkrijgen.
OPMERKING: Deze stappen worden bereikt in 15 tot 20 minuten. AGs moeten er gezond uitzien en de peristaltische bewegingen van de spierlaag rond klieren moeten zichtbaar zijn. GFP kan worden bewaakt met behulp van een fluorescerende microscoop.
- Breng accessoirewartels over op 1x PBS voor een wasbeurt van 1-2 minuten op kamertemperatuur.
OPMERKING: Voor een betere dissociatie is het noodzakelijk om de klieren te spoelen met PBS. De duur van deze stap moet echter worden beperkt omdat de cellen tekenen van stress vertonen in PBS; gedissocieerde secundaire cellen in PBS zwellen snel op en sterven af.
- Verdun 20 μL papaïne [50 U/ml] in 180 μL 1x trypsine-enzym om de dissociatieoplossing te verkrijgen (om op of neer te schalen, houd 9 μL trypsine-enzym en 1 μL papaïne voor elke man). Breng met een tang accessoireklieren over naar deze oplossing.
- Isoleer de punt van accessoireklieren (die secundaire cellen bevatten) van het proximale deel. Gebruik fijne tang om stevig het midden van een klierkwab te knijpen en snijd met de scherpe punt van een tweede tang. Verwijder het proximale deel van accessoireklieren en het ejaculatoire kanaal om de dissociatie te verbeteren en de sorteertijd van cellen te verkorten.
OPMERKING: Het ontleden van het distale deel van 20 paar klieren duurt 15 tot 20 minuten en de spijsvertering door peptidasen begint dus bij kamertemperatuur.
- Nadat alle klierpunten zijn ontleed, breng u ze over in een buis van 1,5 ml met behulp van een speciale pipetpunt van 200 μL die is voorbereid bij stap 1.2.1. Het moet breed, afgerond en nat zijn voordat het klieren behandelt.
OPMERKING: Om accessoire klierweefsel te pipetten, moeten de uiteinden altijd voor nat zijn met de juiste oplossing (trypsine-enzym of SSM, bewaar hiervoor één buis van elk). Spoel de tips tussen de monsters zorgvuldig af om verontreiniging te voorkomen.