$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dit protocol is ontleend aan Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogene mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).
1. Ontwerp van MB's voor Live Cell Imaging
-
Vouw de doel-RNA-reeks om de secundaire structuur van het mRNA-doel te voorspellen met behulp van het "RNA-formulier" van de mfold-server (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Plak/upload de doelvolgorde in FASTA-formaat, selecteer 5 of 10% suboptimaliteit (structuren met een vrije vouwenergie binnen respectievelijk 5 of 10% van de MFE-waarde) en pas het maximale aantal berekende vouwen dienovereenkomstig aan (bijv. groter voor 10% suboptimaliteit).
OPMERKING: Opname van suboptimale secundaire structuren bij het ontwerpen van MB's maakt het mogelijk om regio's binnen het doel mRNA te identificeren die flexibeler of stijver kunnen zijn dan voorspeld voor de minimale vrije energie (MFE) structuur alleen, wat het algehele ontwerp van MB's verbetert die geschikt zijn voor live celbeeldvorming.
- Selecteer een "onmiddellijke taak" voor mRNA-doelen van 800 nucleotiden (nt), of een "batchtaak" voor mRNA-lengtes tussen 801 en 8.000 nt. Sla het bestand "ss-count" op als eenvoudig tekstbestand.
-
Gebruik het bestand "ss-count" verkregen in stap 1.1 als invoer voor het PinMol-programma (https://bratulab.wordpress.com/software/) met de gewenste parameters, om verschillende MB's te ontwerpen voor het mRNA-doel (zie tutorials die het gebruik van het PinMol-programma beschrijven op https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
- Bepaal de specificiteit van geselecteerde MB's door BLAST-analyse uit te voeren: gebruik "blastn" met de juiste database (gebruik bijvoorbeeld voor oskar mRNA-specifieke MB's de "refseq-rna" database en het Drosophila melanogaster organisme).
- Identificeer weefselspecifieke expressie van mRNA-doel (bijv. voor oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray of modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) en vergelijk met eventuele positieve BLAST-hits. Elimineer sondes die >50% cross-homologie vertonen met andere mRNAs die ook worden uitgedrukt in het weefsel/de cel van belang.
- Selecteer het fluorofoor- en quencherpaar dat geschikt is voor de microscopie-opstelling die beschikbaar is om live celbeeldvorming uit te voeren (bijv. Cy5/BHQ2).
2. MB Synthese, zuivering en karakterisering
- Gebruik interne synthese en zuivering zoals eerder beschreven in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006), of diensten van commerciële aanbieders, om één tot vijf MB's te synthetiseren en te zuiveren (zie bovenstaande opmerking), met behulp van het volgende etiketteringsschema: [5'(Fluorofoor)-(C3 of C6 linker)-(2'-O-methyl MB-sequentie)-(Quencher)3']. Zuiver MB's met behulp van reverse-phase HPLC, in eigen huis of met behulp van de diensten van de commerciële provider.
OPMERKING: De fosforamidieten die worden gebruikt voor geautomatiseerdesondesynthese moeten de 2'- O-methylribonucleotidemodificatie hebben. Men kan ook chimera's van afwisselend locked-nucleic acid (LNA) en 2'-O-methyl modificaties gebruiken om de stabiliteit van een hybride tussen een kortere MB en zijn doel mRNA te verhogen.
- Synthetiseer DNA-oligonucleotiden die overeenkomen met de volgorde van het beoogde RNA-gebied en dus complementair zijn aan het sondegebied van MB's, voor gebruik in in vitro karakterisatie (zie stappen 2.3 tot 2.5; bovenstaande opmerking). Maximaliseer hybridisatie van de MB met de DNA-oligonucleotide doel mimic, door aan elk uiteinde van het DNA-doel vier extra nucleotiden op te nemen, zoals gevonden in de doel mRNA-sequentie.
OPMERKING: Een strengere karakterisering van de efficiëntie van de MB om de beoogde sequentie te detecteren, kan worden uitgevoerd met behulp van in vitro gesynthetiseerde RNA-doelen in plaats van complementaire DNA-oligonucleotiden.
- Voer alleen thermische denaturatie van de MB uit, meet de smelttemperatuur (Tm) en bevestig dat de MB de gewenste haarspeldvorm aanneemt bij fysiologische temperatuur. We hebben Tm-waarden waargenomen tussen 60 en 90 °C.
- Voer thermische denaturatie van de MB uit in aanwezigheid van het DNA-oligonucleotidedoel en meet de TM van de MB:DNA-doelhybride, zoals eerder beschreven in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Een Tm tussen 55 en 60 °C is gewenst voor de MB:DNA hybride.
- Voer in vitro hybridisatiereacties uit met het overeenkomstige DNA-oligonucleotidedoel en bepaal de efficiëntie van MB:DNA hybride vorming bij fysiologische temperatuur, zoals eerder beschreven in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Snelle hybridisatiekinetiek met de DNA-doel nabootsing is gewenst, maar MB's die geen hoge hybridisatie-efficiëntie vertonen met DNA-doelen kunnen een betere prestatie hebben met het doel mRNA in vitro en/of in vivo.
3. Dissectie en voorbereiding van individuele eierkamers voor micro-injection
- Voer nieuw uitgekomen, gepaarde vrouwtjes gedurende 2-3 dagen met verse gistpasta.
- Verdoof vliegen op een CO2-pad en breng, met behulp van een fijn pincet (Dumont #5), 1-2 vrouwtjes over in een druppel Halocarbon-olie 700 op een glazen afdekstrook.
- Oriënteer de vlieg met een pincet met de rugzijde omhoog onder een stereomicroscoop. Ontleed de vrouwelijke buik door een kleine incisie aan het achterste uiteinde te maken en knijp het paar eierstokken voorzichtig in de olie.
- Explant de eierstokken op een oliedruppel op een nieuwe deklip. Houd voorzichtig een eierstok vast met één pincet terwijl u de jongste stadia van de ovariole afknijpt met de andere pincet. oskar mRNA is actief gelokaliseerd op en na mid-oogenese (stadia > 7), en jongere eikamers (stadia < 7) zijn moeilijker te injecteren en overleven niet zo lang. Sleep langzaam op de afdekslip (met een neerwaartse beweging) totdat individuele ovarioles of eierkamers verticaal zijn geïsoleerd en uitgelijnd. Scheid verder enkele eierkamers door de ongewenste stadia van de ovariole-eierketen te verplaatsen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat individueel geplaagde eierkamers niet in de olie drijven en dat ze zich aan de afdekstrip hechten. Dit is belangrijk voor zowel succesvolle micro-injectie als beeldverwerving.
4. Micro-invoeging van MB's in de verpleegkundige cellen van eierkamers
- Bereid de MB-oplossing voor met behulp van één moleculair baken (bijv. osk2216Cy5), of een mix van twee MB's die zich richten op verschillende mRNAs en die zijn gelabeld met spectraal verschillende fluoroforen (bijv. osk2216Cy5 en drongo1111Cy3). Gebruik een concentratie van 200-300 ng/μL per MB in HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 en 100 mM NaCl). Voor een cocktail van vier MB's met hetzelfde fluorofoor die zich richten op hetzelfde mRNA bij elk 200 ng/μL in HybBuffer (bijv. osk82, osk1236, osk2216). Draai de MB-oplossing onmiddellijk voordat u de naald laadt voor micro-injectie.
- Selecteer de doelstelling. Een 40x oliedoelstelling wordt aanbevolen voor het vinden van een geschikte eierkamer en voor het uitvoeren van micro-injection.
- Monteer de afdeklip met ontlede eierkamer op het microscoopstadium. Breng het doel naar voren in de focuspositie en identificeer een eikamer in een midden- tot late ontwikkelingsfase, die goed is gericht op micro-injection (d.w.z. met de AàP-as loodrecht op de naaldpunt om een eenvoudige injectie in een verpleegkundige cel proximaal aan de oöcyt mogelijk te maken).
- Laad een naald (commercieel of in huis bereid) met ~1 μL MB oplossing (zie stap 1.1) en sluit deze aan op de micro-injector. Voor micro-injections in D. melanogaster eikamers, oriënteer de naald (zie Tabel van Materialen) onder een hoek <45° naar het microscoopstadium (bijv. 30°) om te voorkomen dat meerdere verpleegstercellen worden doorboord.
- Stel de injector in met een injectiedruk van 500-1.000 hPa en een compensatiedruk van 100-250 hPa (zie tabel met materialen).
- Verplaats langzaam het podium om een deel van de oliedruppelleegte van eierkamers in het gezichtsveld te brengen.
- Laat met behulp van de micromanipulator joystick de naald voorzichtig in de oliedruppel zakken en breng de punt in de richting van de periferie van het gezichtsveld.
- Voer een 'schone' functie uit om de lucht uit de punt van de naald te verwijderen en ervoor te zorgen dat er stroom uit de naald komt.
- Breng de naald naar de thuispositie en concentreer u op de te micro-injecteren eikamer, breng de naald vervolgens weer scherp en plaats deze in de buurt van de rand van de eierkamer.
- Voer een fijne aanpassing uit van de Z-positie van het objectief, zodat het membraan dat de follikelcellen van verpleegkundige cellen scheidt, scherp is.
- Steek de naald in een verpleegkundige cel en voer de injectie uit gedurende 2-5 s.
- Verwijder de naald voorzichtig en trek deze terug naar de thuispositie.
- Wijzig het doel in de gewenste vergroting voor beeldverwerving (60-63x of 100x), focus op de eierkamer en begin met acquisitie.