Micro-injection van Drosophila Verpleegkundige Cellen: Een Methode van Intracellulaire Levering

Samenvatting

Bron: Catrina, I. E., et al. Visualiseren en volgen van endogene mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J.Vis. Exp. (2019).

Vanwege hun grote omvang en relatief eenvoudige organisatie zijn drosophila-verpleegkundige cellen bij uitstek geschikt voor live celbeeldvormingsstudies. Deze video beschrijft een micro-injectiemethode voor de levering van exogene verbindingen in de cellen, en het aanbevolen protocol demonstreert de procedure met fluorescerende oligonucleotide-sondes genaamd moleculaire bakens (MB's) die worden gebruikt om endogene mRNA-transcripties te visualiseren.

Protocol

Dit protocol is ontleend aan Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogene mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).

1. Ontwerp van MB's voor Live Cell Imaging

1. Vouw de doel-RNA-reeks om de secundaire structuur van het mRNA-doel te voorspellen met behulp van het "RNA-formulier" van de mfold-server (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. Plak/upload de doelvolgorde in FASTA-formaat, selecteer 5 of 10% suboptimaliteit (structuren met....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing