$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dit protocol is een fragment uit Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).
1. Vlieggenetica en screening (figuur 1 en figuur 2)
- Wanneer de geïnjecteerde embryo's zich ontwikkelen tot volwassenen, kruis dan elke enkele G0-vliegen naar balancervliegen. Selecteer een geschikte balancer voor het chromosoom dat het beoogde allel bevat.
- Verdoof de F1-nakomelingen van elk G0-kruis op een CO2-pad en pluk willekeurig 10-20 mannetjes onder een stereomicroscoop. Kruis ze afzonderlijk aan de balancervrouwen zoals weergegeven in figuur 2.
- Wanneer de F2-larven uitkomen, kiest u de enige F1-vader uit elk kruis en extraheert u gDNA met behulp van het genomische DNA-voorbereidingsprotocol met één vlieg:
- Bereid gDNA extractiebuffer: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, bewaren bij kamertemperatuur. Bereid 20 mg/ml Proteinase K voorraadoplossing en bewaar in de vriezer.
- Doe elke vlieg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en label de buis. 's Nachts in de vriezer van -80 °C bewaren.
- Bereid een nieuw werkvolume gDNA-extractiebuffer voor met een eindconcentratie van 200 μg/ml Proteïnase K.
Opmerking: Gebruik geen oude buffer voor deze stap.
- Squish elke vlieg gedurende 10-15 s met een pipetpunt met 50 μL squishing buffer zonder de vloeistof te doseren. Verdeel de resterende buffer in de buis en meng goed. Incubeer bij 37 °C gedurende 20-30 minuten.
- Doe de buizen 1-2 minuten in een hitteblok van 95 °C om de Proteinase K te inactiveren.
- Draai 5 min naar beneden op 10.000 x g. Bewaar de bereiding bij 4 °C voor verdere PCR-analyse.
- Gebruik dezelfde methode om gDNA voor te bereiden van een nos-Cas9 vlieg, die dient als een negatieve controle. Voer pcr-schermen in drie stappen uit om de juiste "ends out" HDR (figuur 1, figuur 3) te identificeren met gDNA van elke F1-man als sjabloon5. Gebruik 1 μL van de DNA prep in het volgende PCR-reactiesysteem: 10 μL 2x PCR Master Mix met Dye, 1 μL van elke primer (10 μM), 1 μL DNA-sjabloon en 7 μL ddH2O.
- Zoals weergegeven in figuur 3A, voert u PCR uit met primers fwd1 en rev1 om te screenen op het bestaan van de invoeging of vervanging; pcr uit te voeren met behulp van fwd2- en rev2-primers om de invoeging of vervanging uit de 3'-regio te controleren; voer PCR uit met primers M13F en rev3 om "ends-in" HDR (Tabel 1C) te controleren.
- Houd de vlieglijnen met de bevestigde ends-out HDR en stel evenwichtige voorraden van de F2-generatie vast. Outcross naar de balancer vliegt weer om onbedoelde mutaties op andere chromosomen te verwijderen.
