Dit protocol is een uittreksel uit Sunderhaus en Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Het bevestigen van het hoofd op kragen en inbedding in paraffine
OPMERKING: Alle stappen in het fixatieproces moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. Methylbenzoaat vormt geen gezondheidsrisico, maar heeft een zeer duidelijke geur, die overweldigend kan zijn als het niet in een zuurkast wordt behandeld.
- Voordat u de vliegen verdooft, moet u 50 ml Carnoy-oplossing maken door 15 ml chloroform en 5 ml ijsazijn toe te voegen aan 30 ml 99% ethanol (meng de chloroform en het azijnzuur niet). Giet het in een glazen container met een platte bodem, zoals een kristalliserende schaal, om ervoor te zorgen dat de kragen plat kunnen liggen en volledig bedekt zijn met de oplossing.
- Verdoof de vliegen met CO2 of ether.
- Draadvliegen (tot 20 met de meeste kragen) door hun nek in de kragen met behulp van een tang. Vergeet niet om alle hoofden in dezelfde richting uit te lijnen, zoals te zien is in figuur 1A, en wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen schade aan het hoofd of de ogen optreedt.
- Neem sinus oculisvliegen (pijlen, figuur 1A) op willekeurige posities op, zodat de volgorde van de vliegen gemakkelijk in de secties kan worden geïdentificeerd. Bovendien, als de experimentele vliegen een lichte of witte oogkleur hebben, rijg dan enkele roodogige vliegen, zoals wild type, tussen hen om ervoor te zorgen dat er voldoende pigment aanwezig is om de dia te bevlekken. Noteer de volgorde van de vliegen op een protocolblad samen met het halsbandnummer als u meer dan één halsband gebruikt.
- Zodra een halsband klaar is, plaatst u deze gedurende 3,5 - 4 uur in de voorbereide Carnoy-oplossing.
- Gooi de Carnoy-oplossing in de juiste afvoerbus en begin met het wassen van ethanol. Zorg ervoor dat u langzaam giet om de plaatsing van de kragen in de container niet te verstoren.
- Was de kragen twee keer gedurende 30 minuten in 99% ethanol.
- Was de kragen 1 uur in 100% ethanol. Zorg ervoor dat u de wasbeurten op tijd verwisselt om overdehydratie te voorkomen.
- Doe de kragen in methylbenzoaat O/N bij RT. Sluit de container af met parafilm om verdamping van het methylbenzoaat te voorkomen.
- Giet het methylbenozaat in de juiste wegwerpcontainer in de zuurkast. Voeg een eerder bereid mengsel van 1:1 laag smeltpunt (56 - 57 °C) paraffinewas en methylbenzoaat toe. Vanaf dit punt moeten de kragen in een incubator bij 65 °C worden bewaard om ervoor te zorgen dat de paraffine niet uithard.
- Giet het methylbenozaat- en paraffinemengsel uit in de juiste wegwerpcontainer en giet gesmolten zuivere paraffinewas, bewaard op 65 °C, op de kragen.
- Vervang de paraffine na 30 minuten en herhaal dit minstens 5 keer. Er moeten ten minste 6 - 8 wasbeurten worden uitgevoerd.
- Zodra de wasbeurten zijn voltooid, plaatst u de kragen in een rubberen ijsblokjesbak met sleuven ter grootte van de kragen. Giet gesmolten paraffine erover tot het volledig bedekt is en laat het O/N uitharden (probeer luchtbellen te vermijden).
- Verwijder de paraffineblokken met de kragen uit de ijsblokjesbak. Scheid het paraffineblok van de kraag met behulp van een scheermesje en breek de kraag voorzichtig af. De hoofden zullen in het paraffineblok zitten, terwijl de lichamen in de kraag blijven. De blokken kunnen op kamertemperatuur worden gehouden.
- Om de kragen schoon te maken, weekt u ze in een deparafinisatiemiddel bij 65 °C om de paraffine te verwijderen, reinigt u met lichte schrobbeurten en wast u ze in ethanol voordat u ze opnieuw gebruikt.
