Methodenartikel

Voorbereiding van vaste Drosophila-oöcyten voor immunostaining: een methode met hoge doorvoer om het buitenste membraan te repareren en te verwijderen

30 april 2023

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bron: Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J.Vis. Exp. (2016).

Immunostaining van Drosophila late-stage oöcyten kan een uitdaging zijn vanwege de omliggende membranen van de oöcyten. Deze video beschrijft een methode met hoge doorvoer voor het verkrijgen van oöcyten, hun fixatie en het verwijderen van membranen voor immunostaining. Het aanbevolen protocol demonstreert deze technieken met laat stadium oöcyten die worden gebruikt om verschillende stadia van meiose te visualiseren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is overgenomen uit Radford en McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

OPMERKING: Procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Temperatuurgecontroleerde incubators worden gebruikt om temperaturen voor vliegopfok en kruisen te handhaven, tenzij anders vermeld.

1. Voorbereidingen

  1. Bereid vliegen voor.
    1. Prometaphase-verrijkte oöcytcollecties.
      1. Duidelijke volwassen vliegen van gezonde, jonge stam of dwarsculturen. Verouder fless....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
DrugOplosmiddelVoorraadconcentratieEindconcentratieTijdstip van de behandelingEffect
colchicineEthanol125 mM150 μM10 min of 30 mindestabiliseren niet-kinetochore (10 min)
of alle (30 min.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16% formaldehydeTed Pella, Inc.18505HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakersVarious
5 ml tubesVarious
active dry yeastVariousmix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2SigmaB1186HAZARDOUS
blenderVarious
bovine serum albuminSigmaA4161
calcium chlorideVarious
colchicineSigmaC-9754HAZARDOUS
coverslipsVWR48366-227No. 1 1/2
DMSOVarious
EGTAVarious
ethanolVarious
forcepsTed Pella, Inc.5622Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slidesVWR48312-003
glucoseVarious
HEPESVWREM-5330available from several venders
magnesium chlorideVarious
large mesh (~1,500 µm)VWRAA43657-NKvariety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)Spectrum labs146 424variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutatorVarious
Pasteur pipetsVarious
potassium acetateVarious
Cacodylic acidSigmaC0125HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxideVarious
sodium acetateVarious
sodium hydroxideVarious
sucroseVarious
taxol (paclitaxel)SigmaT1912HAZARDOUS
Triton X-100FisherPI-28314
Tween 20FisherPI-28320
vortexVarious

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Protocol voor oocytfixatiemembraanverwijdering en immunovleuringheptaanfixatiemechanische scheidingmaasfiltratiepreparatie van glazen objectglaasjesvleuring van meiose Iverwijdering van het chorion

Gerelateerde artikelen