$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dit protocol is overgenomen uit Radford en McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).
OPMERKING: Procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Temperatuurgecontroleerde incubators worden gebruikt om temperaturen voor vliegopfok en kruisen te handhaven, tenzij anders vermeld.
1. Voorbereidingen
- Bereid vliegen voor.
- Prometaphase-verrijkte oöcytcollecties.
- Duidelijke volwassen vliegen van gezonde, jonge stam of dwarsculturen. Verouder flessen gedurende twee dagen bij 25 °C.
OPMERKING: Over het algemeen volstaan twee gezonde flessen, hoewel er meer nodig kan zijn voor sommige kruisingsculturen.
- Verzamel na twee dagen ~ 100 tot 300 vrouwtjes (die op dit moment 0 tot 2 dagen oud zijn) uit de flessen. De vrouwtjes hoeven geen maagden te zijn. Voeg een beetje gistpasta toe aan de zijkant van een flacon en plaats 30 vrouwtjes en 10 tot 15 mannetjes elk in de gegiste flacons. Verouder flacons gedurende twee dagen bij 25 °C.
- Met metafase verrijkte oöcytcollecties.
- Verzamel ~ 100 tot 300 vrouwtjes uit stam- of kruisingsculturen. Voeg een beetje gistpasta toe aan de zijkant van een flacon en plaats elk 30 vrouwtjes (zonder mannetjes toegevoegd) in de gegiste flacons. Verouder flacons gedurende drie tot vijf dagen bij 25 °C.
- Oplossingen voorbereiden.
OPMERKING: Oplossingen mogen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard, tenzij anders vermeld.
- Bereid gemodificeerde Robb's Buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sucrose, 275 mM natriumacetaat, 200 mM kaliumacetaat, 50 mM glucose, 6 mM magnesiumchloride en 5 mM calciumchloride. Gebruik 10 N 11:8 natriumhydroxide:kaliumhydroxide om de pH op 7,4 te brengen. Steriliseren door filtratie; niet autoclaaf. Bewaren bij -20 °C. Ontdooi indien nodig om ~200 ml 1x Robb's per oöcyt prep te bereiden.
- Fixatie oplossingen.
- Optie #1: Bereid formaldehyde/heptaanfixatie voor. Fixatiebuffer voorbereiden: 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) plus 150 mM sacharose. Te gebruiken, vers maken met 687,5 μl Fixatie buffer en 312,5 μl 16% formaldehyde per oöcyt prep.
LET OP: Draag handschoenen tijdens het gebruik van formaldehyde-oplossingen in een zuurkast. Gooi afval weg volgens de institutionele richtlijnen.
- Optie #2: Bereid formaldehyde/cacodylaat fixatie voor. Prepare Fix Mix: 250 mM sucrose, 100 mM kaliumacetaat (pH 7,5), 25 mM natriumacetaat (pH 7,0) en 25 mM EGTA (pH 8,0). Te gebruiken, vers maken met 400 μl Fix Mix, 100 μl kalium cacodylaat (1 M, pH 7,2) en 500 μl 16% formaldehyde per oöcyt prep.
LET OP: Kaliumcacodylaat bevat arseen.
- Pbs/Triton X-100 voorbereiden: 1x PBS plus 1% of 0,05% Triton X-100. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumine (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) en 0,1% Tween-20. Kan een week bij 4 °C worden bewaard.
2. Verzameling drosophila-oöcyten in een laat stadium
- Aangezien Drosophila-oöcyten met intacte membranen aan plastic en glas blijven plakken, moet u de binnenkant van één buis van 5 ml en één Pasteur-pipet per oöcytvoorbereiding voorschilderen met PTB.
- Verdoof alle ~100 tot 300 gegiste vliegen met kooldioxide en voeg toe aan een blender met ~100 ml 1x Robb's Buffer. Pulseer drie keer (~ 1 sec elk). Houd oöcyten in Robb's gedurende <20 min om activering te voorkomen.
OPMERKING: Als alternatief kunnen oöcyten met de hand worden ontleed van vrouwtjes. Het voordeel van deze methode is dat het minder vrouwtjes vereist. Er moet echter voor worden gezorgd dat de blootstelling aan kooldioxide tot slechts een paar minuten wordt beperkt om artefacten in verband met hypoxie te voorkomen.
- Filtreer door groot gaas (~ 1.500 μm) in een bekerglas van 250 ml om grote lichaamsdelen te verwijderen. Als er veel intacte buiken op gaas achterblijven, maalt u het materiaal opnieuw met extra Robb's Buffer en filtert u opnieuw. Laat ~2 min bezinken, aspireer dan van de bovenste laag en verwijder zoveel mogelijk van de grote lichaamsdelen.
- Filtreer door klein gaas (~300 μm) in een bekerglas van 250 ml. Spoel de resterende oöcyten uit het eerste bekerglas met extra Robb's en gecoate Pasteur pipet. Laat ~3 min; oöcyten zullen zich vestigen. Aspireer alles behalve ~ 10 ml.
- Giet zoveel mogelijk van de 10 ml als in een gecoate buis van 5 ml past. Laat bezinken, verwijder vloeistof en herhaal met rest. Spoel de resterende oöcyten uit het bekerglas met extra Robb's en gecoate Pasteur pipet. Laat bezinken in 5 ml buis voor ~ 3-5 min.
3. Medicamenteuze behandelingen (optioneel)
- Bekleed een tweede tube van 5 ml met PTB voor elke oöcytvoorbereiding. Voeg het juiste oplosmiddel (controlemiddel) of medicijn toe aan 1 ml Robb's elk voor elke oöcytvoorbereiding (Tabel 1).
- Splits oöcyten in een tweede gecoate buis van 5 ml. Laat bezinken, verwijder vloeistof en voeg 1 ml Robb's plus oplosmiddel toe aan één tube en 1 ml Robb's plus drug in de tweede tube. Nutaat gedurende de juiste tijd voor medicamenteuze behandeling (Tabel 1). Laat je schikken.
4. Fixatie
- Aspireer alle vloeistof en voeg onmiddellijk 1 ml Fix toe.
- Optie #1: Formaldehyde/heptaanfixatie (Fixatiebuffer plus 5% formaldehyde).
- Fix gedurende 2,5 min op een nutator. Voeg 1 ml heptaan en vortex 1 min toe. Laat ~1 min.
- Verwijder alle vloeistof en voeg vervolgens 1 ml 1x PBS toe. Vortex 30 sec. Laat ~1 min.
- Verwijder alle vloeistof en vul de buis met 1x PBS.
OPMERKING: Oöcyten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of enkele uren bij kamertemperatuur op de nutator worden bewaard.
- Optie #2: Formaldehyde/cacodylaat fixatie (Fix Mix plus 8% formaldehyde en 100 mM cacodylaat).
- Fix gedurende 6 minuten op een nutator. Laat 2 min. bezinken. Verwijder de vloeistof en vul de buis met 1x PBS.
OPMERKING: Oöcyten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of enkele uren bij kamertemperatuur op de nutator worden bewaard.
5. Membranen verwijderen ("Rollen")
- Voeg met behulp van gecoate Pasteur pipet ~ 500 tot 1.000 oöcyten toe aan het berijpte (gezandstraalde) deel van een glazen glijbaan. Verwijder alle lichaamsdelen en vreemde materialen met een tang. Laat oöcyten niet uitdrogen; voeg indien nodig 1x PBS toe.
- Plaats een coverslip bovenop de oöcyten en "rol" voorzichtig oöcyten totdat alle membranen zijn verwijderd (het slepen van de rand van de coverslip over de oöcyten werkt het beste). Controleer regelmatig de voortgang onder de microscoop en voeg indien nodig meer 1x PBS toe. Wees voorzichtig, want te veel druk zal de oöcyten vernietigen.