Dit protocol is een fragment uit Perkins and Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).
1. Verwijdering van Chorions en Vitelline Membranen
OPMERKING: Zie figuur 1 voor het benodigde gereedschap.
- Aparte late stadium oöcyten
- Voeg 1 ml PBSBTx toe aan een ondiepe ontleedschaal. Gebruik een P200 met een BSA gecoate punt om vaste eierstokken (in ~150 μL) in de ondiepe schaal over te brengen. Pipet eierstokken op en neer met de BSA gecoate pipet tip om de volwassen oöcyten los te maken van de minder volwassen oöcyten.
- Wanneer laat stadiumoöcyten voldoende gescheiden zijn, breng dan al het weefsel over naar een microfugebuis van 500 μL. Verwijder overtollige vloeistof met een getrokken Pasteur pipet en laat ongeveer 150 - 200 μL in de buis achter. Herhaal rubriek 1.1 voor de resterende genotypen.
- Bereid je voor op het rollen
- Maak een diepe putschaal met 200 μL PBSBTx voor. Dek af en zet opzij. Verkrijg 3 matglazen dia's en zet #3 opzij. Wrijf voorzichtig de matglazen gebieden van dia's #1 en #2 samen. Spoel ze af in gedeioneerd water om eventuele glasscherven te verwijderen en droog ze af met een wegwerpdoekje.
- Bedek de berijpte gebieden van dia's #1 en #2 met PBSBTx door 50 μL PBSBTx aan de ene dia toe te voegen en dit gebied met de andere dia te wrijven. Verwijder vloeistof met een wegwerpdoekje.
- Plaats de dia's onder een ontleedmicroscoop in de configuratie in figuur 2A. Houd de berijpte gebieden van dia's #1 en #2 in contact, met #3 glijbaan #2 ondersteunen.
- Roloöcyten; zorg ervoor dat de rolrichting altijd in een rechte lijn is en nooit in een cirkelvormige beweging.
- Prewet een P200 pipet tip in PBSBTx en verspreid de oöcyten in de microfuge buis door pipetten op en neer. Breng 50 μL vloeistof met oöcyten over naar het midden van het matglazen deel van de #1. Til #2 om dit te doen.
- Laat de schuif #2 langzaam zakken totdat de oppervlaktespanning van de vloeistof een afdichting creëert tussen de twee matglazen gebieden. Er moet voldoende vloeistof zijn om het berijpte gebied te bedekken, maar er mag geen uitsijpelen. Als de vloeistof overloopt, gebruik dan een getrokken Pasteur pipet om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Houd de onderste dia (#1) met de ene hand op zijn plaats en gebruik de andere hand om de bovenste dia (#2) in horizontale richting heen en weer te bewegen, waarbij de dia #2 niveau blijft en ondersteund op dia #3. Voer uit onder een microscoop voor eenvoudige visualisatie van oöcytbewegingen en voortgang.
OPMERKING: Deze beweging zal wrijving genereren en ervoor zorgen dat de oöcyten "rollen" en hun koraal verliezen. Minimale druk moet worden gebruikt en bewegingen moeten kort en snel zijn.
- Na enkele bewegingen in horizontale richting de bewegingshoek enigszins wijzigen (figuur 2B). Verhoog deze hoek in meerdere stappen geleidelijk tot 90° totdat de beweging van de bovenste dia (#2) loodrecht op de beginrichting staat (figuur 2B). Merk op dat legechorionen zichtbaar zullen zijn in de vloeistof en dat oöcyten zonder koraal langer en dunner zullen lijken.
- Herhaal stap 1.3.3 - 1.3.4 ongeveer 7 - 10 keer totdat de oplossing enigszins troebel wordt. Stop met rollen wanneer de meerderheid van de oöcyten (75 - 85%) lijken hun vitellinemembranen te hebben verloren.
OPMERKING: Een onderscheidend puntig uiteinde is vaak zichtbaar op oöcyten zonder vitellinemembranen. Vitelline membranen zijn moeilijker te verwijderen dan koraal. Lichte druk kan worden uitgeoefend op de bovenste dia (schuif #2) tijdens het rollen om de verwijdering van vitelline membranen te bereiken. Proberen om vitelline membranen te verwijderen uit alle oöcyten resulteert vaak in vernietiging van andere oöcyten.
- Til de bovenste dia (#2) voorzichtig op en sleep een van de hoeken naar het midden van het berijpte gebied van de onderste dia (#1) zodat gerolde oöcyten zich ophopen in het midden van het berijpte gebied. Spoel oöcyten van beide dia's met PBSBTx in de diepe putschaal met PBSBTx.
- Reinig dia's #1 en #2 met ultrapure water, droog met een wegwerpdoekje en reset. Herhaal stap 1.3.1 - 1.3.6 totdat alle oöcyten van hetzelfde genotype zijn gerold. Dit vereist meestal 3 - 4 rollen per genotype.
- Verwijder vuil na het rollen
- Voeg 1 ml PBSBTx toe aan een conische buis van 15 ml. Wervel de vloeistof om de zijkanten van de buis te coaten.
- Breng met behulp van een PBSBTx gecoate P1000 pipetpunt de gerolde oöcyten over van de diepe putschaal naar de conische buis met 1 ml PBSBTx. Voeg nog eens 2 ml PBSBTx toe aan de conische buis die de oöcyten bevat.
- Laat de oöcyten naar de bodem bezinken en verwijder vervolgens de bovenste 2 ml oplossing met vuil (chorions, vitellines, enz.)met een P1000 en gooi deze weg. Houd indien nodig de conische buis tegen een donkere achtergrond om de ondoorzichtige oöcyten te zien terwijl ze zinken.
- Voeg nog eens 2 ml PBSBTx toe aan de oöcyten en herhaal stap 1.4.3. Herhaal 1.4.3. voor in totaal 3 rondes puinverwijdering.
- Breng met behulp van een PBSBTx gecoate P1000 pipetpunt oöcyten terug naar de oorspronkelijke 500 μL microfuge buis. 20 - 25 vrouwtjes moeten ongeveer 50 μL gerolde volwassen oöcyten opleveren.
- Herhaal sectie 4 voor de resterende genotypen met verse matglaasjes, een schone diepe putschaal en een nieuwe conische buis voor elk genotype.
- Indien opslag nodig is, breng oöcyten over naar 1x PBS met 0,1% TritionX-100 en bewaar 's nachts bij 4 °C. Langdurige opslag wordt niet aanbevolen omdat formaldehyde crosslinking kan worden omgekeerd door niet-ionische reinigingsmiddelen.
