Drosophila Late Pupa Indirect Flight Muscle (IFM) Dissectie: een methode voor high-throughput weefselverzameling

Samenvatting

Bron: Kao, S. Y., et al. Dissectie van Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J.Vis. Exp. (2019).

De Drosophila vluchtspieren worden gebruikt als een modelsysteem voor spierontwikkeling en fysiologie. Deze video beschrijft het vluchtspierstelsel van volwassenen en belicht een protocol om het ontwikkelen van indirecte vluchtspieren te ontleden die geschikt zijn voor RNA-sequencing van poppen.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Kao et al., Dissectie van Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. IFM Dissectie Na 48 h APF

1. Monteer de benodigde apparatuur, waaronder twee #5 van biologische kwaliteit, fijne scharen, standaard glasmicroscoopglaasjes, dubbelstokband, pipet, pipettips, droogijs en (voor RNA-toepassingen) isolatiereagens (zie tabel met materialen). Koel de 1x PBS en microcentrifugebuizen op ijs.
2. Breng de geënsceneerde poppen met behulp van een licht bevochtigde penseel over op een strook dubbelzijdig plakband die op een microscoopschuif is gemonteerd (afbeelding 1A). Plaats de poppen in een lijn, georiënteerd in dezelfde richting (ventrale naar beneden en voorste naar de onderkant van de dia).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet te veel water op de kwast of filter gebruikt, anders blijft de poppen niet goed plakken. Als poppen niet plakken, droog ze dan door ze eerst over te brengen op een droog filter of tissuepapier. Monteer zoveel poppen als kan worden ontleed binnen een tijdvenster van 30 minuten, idealiter ~ 10 poppen.
3. Verwijder de pop uit de poppenkast. Gebruik de tang om de pop uit elkaar te plagen en de popkoffer boven de voorste spiracles te openen (figuur 1B).
4. Schuif voorzichtig een tang dorsaal naar de achterste, snijd de popbehuizing terwijl de tang beweegt (Figuur 1B'). Pas op dat u de onderliggende pop niet scheurt. Bevrijd de pop uit de geopende behuizing en breng deze onmiddellijk over in een druppel van 1x PBS op een tweede microscoopschuif (figuur 1B",C).
5. Herhaal stap 1.3 en 1.4 voor alle poppen in de lijn en zet vervolgens de tapeschuif met dubbele stok opzij.
6. Snijd met behulp van de fijne schaar de buik van de pop weg van de thorax en duw deze in een aparte stapel(afbeelding 1D,D'). Herhaal dit voor de resterende poppen.
   OPMERKING: Begin met het timen van de lengte van de dissectie met stap 1.6, zodra de popintegriteit wordt verstoord. Ontleed zoveel mogelijk vliegen in 20-30 minuten om celdood en bijbehorende transcriptomische en proteomische veranderingen te voorkomen. Bij het ontleden van 1 d volwassenen of >90 h poppen, is het vaak handig voor latere stappen om het hoofd extra te verwijderen met de fijne schaar.
7. Verwijder met behulp van een tissuepapier het grootste deel van de 1x PBS (over het algemeen troebel met gesuspendeerd vet) en de stapel buiken (figuur 1E). Voeg een druppel verse, gekoelde 1x PBS toe aan de resterende thoraxen.
8. Gebruik de schaar om de thorax doormidden te snijden (figuur 1F,F') door in één beweging van het hoofd langs de lengteas van het lichaam te snijden. Als de kop is verwijderd, plaatst u eerst de schaar waar de kop is bevestigd en snijdt u de bovenste helft van de thorax in de lengterichting tussen de IFM's. Snijd vervolgens de ventrale kant van de thorax met een tweede snede in dezelfde richting.
9. Herhaal stap 1.7 en 1.8 om alle poppen te ontleden, waardoor een stapel thoraxbloedingen in de buurt van het midden van de glijbaan ontstaat. Zorg ervoor dat er voldoende gekoelde 1x PBS op de glijbaan zit, zodat de hemisections niet uitdrogen.
   OPMERKING: Na 48 h APF zijn IFM's groot genoeg om zichtbaar te zijn onder een standaard ontleedmicroscoop naar het getrainde oog. Op dit punt in het protocol kunnen spieren met een fluorescerend label worden verplaatst naar een fluorescerende ontledingsruimte om te helpen bij IFM-identificatie of voor trainingsdoeleinden, maar dit is niet nodig.
10. Ontleed de IFM's uit de thorax. Isoleer een van de hemisections met behulp van de #5 tang (Figuur 1G,H). Steek voorzichtig de uiteinden van één tang boven en onder het midden van de IFM's (figuur 1G',H'). Terwijl u de eerste tang stil houdt, gebruikt u een fijne schaar om het ene uiteinde van het IFM weg te snijden van de nagelriem en pezen. Snijd vervolgens het andere uiteinde van het IFM vrij van de nagelriem (figuur 1G'',H'').
    OPMERKING: Afhankelijk van de oriëntatie van de thorax na de eerste IFM-snede, is het handig om de thorax 180° te draaien, zodat de tweede IFM-snede gemakkelijker uit te voeren is.
11. Verwijder de IFM-bundel met een tang uit de thorax (afbeelding 1G''',H'''), waarbij deze naar de rand van de PBS-bel wordt overgebracht om waterspanning te gebruiken om deze op zijn plaats te houden (figuur 1I). Duw het karkas naar de andere kant van de glijbaan. Herhaal dit voor de resterende thoraxbloedingen en genereert een verzameling ontlede IFM's.
    OPMERKING: Als de IFM's niet op een nette stapel blijven, verwijder dan een deel van de 1x PBS met een tissue. Zorg ervoor dat niet alle PBS verdampt en zorg ervoor dat de ontleedde IFM's en hemithoraxen bedekt blijven met buffer.
12. Voer na het ontleden van alle IFM's snel een kwaliteitscontrole uit op de ontlede spier. Verwijder met #5 tang eventuele sprongspier- of nagelriemfragmenten die mogelijk hun weg naar het monster hebben gevonden (figuur 1J-K'').
    OPMERKING: Jump spier lijkt anders dan IFM. Als het ontleden van Mef2-Gal4 gelabeld spier onder fluorescentie, sprong spier heeft een zwakkere fluorescentie en een andere vorm en textuur. Bij normaal licht lijkt het bijna doorschijnend, terwijl de IFM's ondoorzichtig, melkgeel zijn (figuur 1J-J'',K).
13. Vang met behulp van waterspanning de ontlede IFMs op (maar niet) tussen een paar tangen (figuur 1L). Breng de IFM's over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml die is voorgevuld met 250 μL gekoelde 1x PBS (figuur 1M). Ga onmiddellijk verder met sectie 2.
    OPMERKING: Wanneer tangpunten in de nabijheid van elkaar worden gebracht en uit een bufferoplossing worden getild, zorgt waterspanning ervoor dat een bufferbel tussen de tangpunten wordt opgevangen. Als IFM's ook in deze bel aanwezig zijn, kunnen ze uit de oplossing worden getild en gemakkelijk worden overgebracht naar een andere met buffer gevulde recipiënt. Het is belangrijk om in de tang te knijpen om de uiteinden bij elkaar te brengen zonder elkaar aan te raken, om te voorkomen dat het weefsel dat in de bufferbel wordt gevangen, wordt gemacereerd.

2. Pellet en behoud van het IFM-monster

1. Pelleteer de IFM's door de microcentrifugebuis van 1,5 ml gedurende 3-5 minuten bij 2.000 x g in een tafelcentrifuge te centrifugeren (figuur 2A,B).
2. Verwijder de buffer met behulp van een pipettip (figuur 2C).
3. Voor RNA-toepassingen moet de IFM-pellet worden geresuspendeerd in 50-100 μL van de gewenste RNA-isolatiebuffer (zie tabel met materialen, figuur 2D). Ga anders verder met stap 2.4.
   OPMERKING: IFM's kunnen na stap 2.2 drooggevroren worden voor massaspectrometriepreparaten of isolatie van RNA met commerciële kits (zie representatieve resultaten). Voor RNA-toepassingen worden betere resultaten verkregen door de IFM-pellet onmiddellijk in isolatiebuffer te resuspenden en in te vriezen.
4. Vries het monster in op droogijs of vries in vloeibare stikstof (figuur 2E). Bewaren bij -80 °C tot het klaar is voor volgende stappen in de monstervoorbereiding voor downstreamanalyse.
   OPMERKING: Na cryopreservatie kunnen monsters enkele maanden worden bewaard voordat ze worden verwerkt voor downstreamonderzoek.

Resultaten

Figuur 1: Dissectie van IFM's na 48 h APF. (A) Uitlijnen van poppen op dubbelstokband. (B) Verwijdering van poppen uit de poppenkast door de pop voorste opening, het dorsaal snijden van de kast (B') en het uittrekken van de pop (B''). Cirkelsymbolen vertegenwoordigden hetzelfde als figuur 2. (C) Overdracht van poppen naar...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
60 mm culture dishes	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9	Samsung	SM-G960F/DS	used for photos not taken under a microscope
Double stick tape	Scotch/3M	3M ID 70005108587	Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2]			Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3]			Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4	Bloomington Stock Center	BDSC:27390	Fly stock
Fly: salm[1]	Bloomington Stock Center	3274	Fly stock
Fly: salm[FRT]			Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR	Vienna Drosophila Research Center	GD41568	Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma	Bloomington Stock Center	BDSC:31776	Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP	Bloomington Stock Center	BDSC:5130	Fly stock
Fly: w[1118]	Bloomington Stock Center	3605	Fly stock
Fly: weeP26			Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster	ChromoTek	gba488-100
Glycogen	Invitrogen	10814-010
Image processing software, Photoshop CS6	Adobe		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol	Life Technologies	15596018	Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit	Invitrogen	AM1907	TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit	Zymo Research	R2070S	RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. <br/>Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Promega	Z6110	We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit	New England Biolabs	T2010G	We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &micro;L of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher	AM12400	RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides	Thermo Fisher	12342108	Standard slides, uncharged, 1 mm
Paintbrush	Marabu	1910000000	Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS buffer (1x)	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips	Elemental Scientific	ES-7000-0101	Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Pipette tips	Sigma-Aldrich	P5161	Universal 200 mL pipette tips
RNA concentration Approach 1 &amp; RNA integrity traces, Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer	Invitrogen	Q33238
RNase A	Promega	A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit	Invitrogen	18080-044	reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript	New England Biolabs	E3010S	reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit	Qiagen	205410	reverse transcription kit
Statistical software: GraphPad Prism	GraphPad Prism		www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel	Microsoft		Purchased as part of the bundle: Office Home &amp; Student 2019
Table-top centrifuge	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Standard tissue wipes
Transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z350796	Plastic pipette
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00	3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper	Sigma-Aldrich	1004-070	Filter paper circles, Grade 4, 70 mm