$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dit protocol is een fragment uit Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).
1. In vivo calcium beeldvorming
- Gebruik een multifotonmicroscoop uitgerust met een infraroodlaser en een wateronderdompelingsobject (zie tabel met materialen),geïnstalleerd op een met trillingen geïsoleerde tafel. Voor de visualisatie van op GFP gebaseerde calciumindicatoren stemt u de laser af op een excitatiegolflengte van 920 nm en installeert u een GFP-banddoorlaatfilter.
- Scan met behulp van de grove Z-instelknop door de Z-as van de hersenen en lokaliseer het hersengebied van belang. Gebruik de bijsnijdfunctie om het scannen op alleen dit gebied scherp te stellen om de scantijd te minimaliseren en om de scanweergave zo te roteren dat de voorste van het hoofd naar beneden is gericht.
- Pas de framegrootte aan op 512 x 512 px, scansnelheid tot > 4 Hz en scangebied (in de Y-dimensie) zodat de neuronen van belang worden behandeld.
2. Visualisatie van geur-opgeroepen calcium transiënten door reukconditionering
- Gebruik een geurafgiftesysteem dat verschillende geurprikkels tijdelijk nauwkeurig kan afgeven.
- Gebruik een extra computer om het apparaat te bedienen en om te communiceren met de beeldmicroscoroscoopsoftware om geurstimulaties te coördineren met beeldopname tijdens experimenten.
- Start een voorgeprogrammeerd macropakket dat de beeldverwervingssoftware en het geurleveringsprogramma kan koppelen (bijv. een VBA-macropakket dat is geïnstalleerd in de microscoopbesturingssoftware, zie Tabel met materialen)dat reageert op een externe invoertrigger die wordt geleverd door het starten van een geurleveringsprotocol in een afzonderlijk programma).
- Start de meting met het monitoren van "pre-training"/naïeve geur-opgeroepen calcium transiënten met een resolutie van 512 x 512 px en een framesnelheid van 4 Hz. Lever een 2,5 s geurprikkel geflankeerd door extra beeldverwerving voor 6,25 s voorafgaand aan het begin van de geur (om een F0 basiswaarde vast te stellen) en 12,5 s na geurcompensatie. Herhaal dit met een tweede geurstof en vervolgens met een derde geurstof.
- Ga 3 min na deze meting verder met klassieke conditionering ("training") de vlieg.
- Selecteer een van de geuren die in de "pre-training" fase worden gepresenteerd om de CS+ geur te worden en een andere om de CS- geur te worden. Presenteer de CS+ geur met behulp van het computergestuurde geurleveringssysteem gedurende 60 s naast twaalf elektrische schokken van 90 V.
- Presenteer na een pauze van 60 s de CS- geur alleen gedurende 60 s. Gebruik als geurstoffen 4-methylcyclohexanol en 3-octanol. Presenteer de derde geurstof (bijv. 1-octen-3-ol) niet tijdens deze training, omdat deze alleen voor (stap 2.2.) en na (stap 2.4) de trainingsfase als controle wordt gebruikt.
- Meet de "post-training" geur-opgeroepen calcium transiënten opnieuw door het herhalen van de "pre-training" geur stimulatie protocol (stap 2.2.) 3 minuten na het beëindigen van de trainingsfase (stap 2.3).
OPMERKING: De timing van deze stap moet de tijd van interesse na geheugenvorming weerspiegelen (voer deze stap bijvoorbeeld 3-4 minuten na de conditioneringsstap uit om het kortetermijngeheugen te onderzoeken). Meestal kunnen vliegen enkele uren overleven in deze voorbereiding.
- Sla beeldbestanden op in een geschikt formaat (bijv. Tiff) voor latere beeldanalyse.