Dit protocol is ontleend aan Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Voorbereiding van dia's voor beeldvorming
- Bereid 3-4% w/v agarose bouillon in een magnetronveilige fles (3-4 g in 100 ml ultrapure water).
OPMERKING: Agar kan worden gebruikt in plaats van agarose in dezelfde concentratie.
- Smelt de agarose voorzichtig in een magnetron en zorg ervoor dat ze niet te veel koken, totdat alle agarose is opgelost (heldere oplossing). Houd de oplossing op 70 °C om stolling te voorkomen.
OPMERKING: Agarose voorraad kan meerdere keren worden gebruikt. Verwarm voor gebruik opnieuw als de agarose gestold is.
- Plaats met behulp van een Pasteur pipet een druppel gesmolten agarose op een microscoopschuif.
OPMERKING: Vermijd het hebben van luchtbellen in de druppel van agar, omdat deze de integriteit van de pad verstoren.
- Druk onmiddellijk de agarosedruppel naar beneden met een andere microscoopschuif en maak de agarose voorzichtig plat in een pad tussen de twee dia's.
OPMERKING: Eventuele overgebleven bubbels moeten in dit stadium worden verwijderd. Zo niet, dan moeten er nieuwe dia's worden gemaakt, omdat dieren gemakkelijk in de bubbels kunnen blijven steken. Vermijd overloop van agar naar de zijkant wanneer u op de dia drukt.
- Laat de agarose 1 min drogen.
- Scheid de twee dia's voorzichtig om schade aan de agarose te voorkomen, terwijl u de gestolde pad op een van de dia's laat staan.
OPMERKING: Dia's met agarose pads moeten altijd vers worden bereid vlak voor het experiment, omdat ze kunnen uitdrogen. Zorg ervoor dat de agarose pad een consistente dikte heeft. Er mogen geen luchtbellen of scheuren in de pad zitten, omdat dit de beeldvorming kan verstoren.
- Voeg een kleine druppel (5-10 μL) van 0,05% tetramisole hydrochloride (verdoving) toe aan het midden van het agarosepad.
- Breng met behulp van warmtegesteriliseerde plectrum snel ongeveer 10 - 15 dieren over van de bouillonplaat naar de verdovingsdruppel voordat de oplossing uitdroogt. Vermijd het overbrengen van te veel OP50-bacteriën, omdat dit de oplossing troebel maakt, wat de beeldvorming kan verstoren.
OPMERKING: Als de verdovingsoplossing tijdens het plukken uitdroogt, spuit dan gewoon een tweede druppel van 0,05% tetramisole hydrochloride op de dieren. De dieren hebben de neiging om op hun laterale kant in de verdovingsoplossing te liggen.
- Breng een coverslip aan door deze net boven de agarose pad te plaatsen en deze voorzichtig naar beneden te laten vallen. Dit voorkomt de vorming van bubbels. Oefen geen druk uit op de afdeklip, omdat dit de dieren kan verpletteren.
- Label de dia's met de stamnaam.