Vierweg Olfactometer-test: een methode om odorant-cued-reacties in Drosophila te beoordelen

Samenvatting

Bron: Lin, C.C., et al. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J.Vis. Exp. (2016).

Fruitvliegen hebben een complex reuksysteem, kunnen honderden geurstoffen onderscheiden en hun reukvermogen gebruiken om gedragsbeslissingen te sturen. Deze video beschrijft de vierweg olfactometertest, een methode om reukgedragsreacties bij vliegen te bestuderen. De uitgelichte protocolclip laat zien hoe om te gaan met testvliegen en wat kritieke stappen zijn tijdens het uitvoeren van de test.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Gedragsreacties op aantrekkelijke en afstotende geurstoffen

1. Schakel de temperatuurregelaar in en stel deze in op 25 °C.
2. Sluit de geurkamers (controle- en testgeurstoffen) aan door de slang in de uitlaat van de geurkamer en op de push-to-connect-fitting op de gedragsbox te plaatsen.
3. Controleer het debiet in elk kwadrant met behulp van de luchtstroommeter om er zeker van te zijn dat de regel- en geurige luchtstroomen gelijk zijn aan 100 ml/min.
4. Reinig de PTFE fly arena en de glazen platen 2-3 keer met 70% ethanol en laat ze volledig aan de lucht drogen (~ 3-4 min).
5. Bevestig de glasplaten met klemmen op de arena.
6. Breng vliegen zonder CO_2-anesthesie door het gat in een van de glasplaten de arena in. Plaats na de overdracht een cirkelvormig gaas op het gat om te voorkomen dat vliegen ontsnappen.
   OPMERKING: Het is aangetoond dat CO_2-anesthesie het gedrag van Drosophila beïnvloedt en mag niet binnen 24 uur na een gedragsexperiment worden gebruikt.
7. Plaats de arena met vliegen in de lichtdichte kamer, sluit de vier regelluchtstromen aan door de slang die is bevestigd aan de push-to-connect-fitting op de gedragsbox aan te sluiten op de arenahoeken, sluit de deur van de kamer en wacht 10-15 minuten om de vliegen te laten acclimatiseren aan de nieuwe omgeving. Schakel indien mogelijk de lichten uit in de ruimte waar de experimenten worden uitgevoerd, om mogelijke minimale lichtlekken te voorkomen die de experimentele uitkomst kunnen beïnvloeden.
8. Voer een controle-experiment van 5-10 minuten uit, waarbij vliegen worden blootgesteld aan 4 controleluchtstromen.
9. Analyseer de gegevens onmiddellijk (zie de sectie Gegevensanalyse hieronder) om ervoor te zorgen dat de vliegen gelijkmatig in de arena worden verdeeld en dat de Attraction Index dicht bij 0 ligt. Deze stap is essentieel, omdat het controleert of er geen ongecontroleerde bronnen van voorkeur of vermijding in de arena zijn(bijv. licht dat van buitenaf lekt, ongelijke temperatuurverdeling, ongelijke arena, geurverontreiniging, enz.). Als de vliegen ongelijk verdeeld zijn of hun motorische activiteit laag is, gooi de vliegen dan weg, maak de arena opnieuw schoon (stap 1.4) en gebruik een nieuwe partij vliegen om het experiment te herhalen.
10. Sluit de testgeurkamer aan op de opstelling door de 3-wegkleppen in te schakelen of de connectorbuizen opnieuw aan te sluiten.
11. Voer het testexperiment gedurende 5-10 minuten uit en analyseer de gegevens zoals besproken in sectie 2 hieronder (figuur 1). Opnames langer dan 20 minuten kunnen resulteren in gegevensbestanden die moeilijk rekenkundig te verwerken zijn. Als langere experimentele opnames gewenst zijn, stop dan snel en start het trackingprogramma opnieuw. Dit resulteert in een gat van ~10 sec tussen experimentele opnames.
12. Gooi vliegen weg.
13. Reinig arena- en glasplaten met 70% ethanol (stap 1.4) en vervang verbindingsbuizen in de lichtdichte behuizing. Om experimenten te versnellen, kan een nieuwe schone arena worden gebruikt en de vuile arena worden schoongemaakt tijdens het uitvoeren van experimentele runs.
14. Voer indien nodig nog een experiment uit met een nieuwe partij vliegen. Als er meerdere experimenten op dezelfde dag worden uitgevoerd, wees er dan uiterst voorzichtig mee om ervoor te zorgen dat er geen geurstof in het systeem achterbleef van een eerdere testrun. Dit is normaal gesproken geen probleem met lage concentraties geurstoffen of met CO_2,maar voor sterk geconcentreerde stimuli kan een kloof van 24 uur tussen experimentele runs nodig zijn. Bovendien kunnen alle slangen na de stroombuizen worden vervangen als geurverontreiniging wordt vermoed tijdens controle-experimenten. Laat de droge lucht altijd tussen de experimenten staan om het systeem continu door te spoelen.

2. Gegevensanalyse

OPMERKING: De voorgestelde software voor het volgen van vliegen (gedetailleerd in Materialen), volgt vliegen in realtime tijdens de acquisitie en bespaart de tijdstempel en coördinaten van alle gedetecteerde vliegen in *.dat formaat. We hebben een op maat gemaakte Matlab-routine ontwikkeld om de gegevens om te zetten in een Matlab-formaat en om de gegevens te analyseren. Codevoorbeelden worden gegeven in aanvullend materiaal, maar details over de implementatie zijn afhankelijk van de software die wordt gebruikt voor het verkrijgen van gegevens.

1. Laad de onbewerkte gegevens. Maak een ruimtelijk masker dat de contouren van de arena volgt en pas het masker toe op de onbewerkte gegevens om alle gegevenspunten te verwijderen die buiten de arena vallen omdat ze ruis vertegenwoordigen(figuur 2A, Aanvullende codemaskerSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Verwijder alle gegevenspunten die langer dan 3s met een snelheid van minder dan 0,163 cm/s bewegen, omdat deze gegevens waarschijnlijk ruis zijn of worden gegenereerd door niet-bewegende vliegen(figuur 2B, Aanvullende code temporalfiltering.m).
3. Visualiseer resterende gegevenspunten door ze allemaal tegelijk of als afzonderlijke trajecten uit te stippelen(figuur 1, Aanvullende code SingleTrajectoryViewer.m).
   OPMERKING: De locatie van geurgrenzen in het vierveld hangt waarschijnlijk af van een aantal factoren, zoals de kenmerken van elke geurstof en de luchtstromingssnelheden die worden gebruikt. Zeer vluchtige geurstoffen zullen bijvoorbeeld waarschijnlijk het geurkwadrant vollediger vullen dan minder vluchtige geurstoffen. Het is dus waarschijnlijk dat elke geurstof iets andere geurgrenzen kan vertonen. Het gebruik van een fotoionisatiedetector om geurgrenzen te meten kan problematisch zijn omdat het een vacuüm gebruikt om lucht van een bepaalde plek te bemonsteren en zo de geurconcentratie op die plek verstoort. Niettemin kunnen geurgrenzen snel worden geschat op basis van vlieggedragsgegevens. Een geurgrens op basis van gecumuleerde vliegsporen als reactie op verschillende geuren kan bijvoorbeeld duidelijk worden waargenomen in figuur 1C en 1D.
4. Bereken een aantrekkingsindex om te bepalen of controle-experimenten geen voorkeursrespons genereren en ook om toegang te krijgen tot de reactie op een geurige (of optogenetische) stimulus. Gebruik de laatste 5 minuten van een controle- of testopname om een Attraction Index (AI) te berekenen. Om een aantrekkingskracht te verkrijgen die tussen +1 (absolute aantrekkingskracht) en -1 (absolute afstoting) valt, wordt de volgende formule gebruikt om de AI te berekenen:
   
   wanneer de_N-test het aantal gegevenspunten in het testkwadrant is, is _N-controle het gemiddelde aantal gegevenspunten in de drie controlekwadranten. Deze meting is intuïtief omdat geen voorkeur zou worden aangegeven door bijna-nulwaarden. Het geeft echter niet correct het aandeel aan van het totale aantal vliegen dat zich in het geurige kwadrant bevindt. Om deze maatregel te verkrijgen, kan een percentageindex (PI) worden gebruikt:
   
   waarbij de_N-test het aantal gegevenspunten in het testkwadrant is en N het totale aantal gegevenspunten in alle vier de kwadranten. Deze formule biedt een maat die tussen 0 en 1 valt, waarbij 0,25 overeenkomt met geen gedragsvoorkeur(figuur 1E en 2C, Aanvullende code AttractionIndex.m).
5. Voer 5-10 herhalingen uit van elke experimentele aandoening, met behulp van een nieuwe groep vliegen voor elke herhaling. Vergelijk de attractie-indexen tussen omstandigheden of tegen bedieningselementen met behulp van de kolmogorov-Smirnov niet-parametrische test(figuur 1F, kstest2 functie in Matlab).

Resultaten

Figuur 1: Voorbeeldgegevens die zijn gegenereerd met behulp van een olfactorische test met vier velden. (A) Schematisch van de vier-veld arena. (B) Neutrale reacties worden waargenomen wanneer alle vier de kwadranten alleen droge luchtperfusie bevatten. (C) Aantrekkingsreacties op een verdunning van 6,25% appelciderazijn doordrenkt uit het linker bovenste kwadrant. (

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
<strong>Air delivery system</strong>			<strong>(Quantity needed)</strong>
<em><strong>Tubing and connectors</strong></em>
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
<em><strong>Air pressure regulator, air filter and flowmeters</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
<em><strong>Fly arena, camera and behavior boxes</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (<a href="https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php" target="_blank">https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php</a>)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
<em><strong>Imaging system</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(<a href="https://www.theimagingsource.com/" target="_blank">http://www.theimagingsource.com/</a>)
<strong>Miscellaneous</strong>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1