Drosophila Y-doolhoftest: een methode om reukreacties bij vliegen te beoordelen

In dit artikel

Samenvatting

Bron: Simonnet, M.M., et al. Testen drosophila Olfaction met een Y-doolhof Assay. J.Vis. Exp. (2014).

Deze video beschrijft een methode om reukgedrag in de fruitvlieg te testen, het Y-doolhof. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u de test instelt en uitvoert.

Protocol

Deze protocoltekst is een fragment uit Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Voordat u begint

Gebruik een geïnogeniseerde referentievoorraad met stabiele en robuuste gedragsfenotypes. Er is geen algemene regel voor het kiezen van dit bestand, omdat alle potentiële controles heterogene achtergrond allelen kunnen dragen.
Gebruik deze controlestam om elke andere voorraad die nodig is voor latere stappen te doorkruisen. Deze backcrossing-stap wordt meestal vertegenwoordigd door ten minste 5 opeenvolgende kruisingen van een enkele maagdelijke vrouw (om mogelijke kruising tussen homologe chromosomen mogelijk te maken) tot 2-3 isogene referentiemannetjes. Deze stap is belangrijk om de genetische achtergrond tussen de verschillende vliegbestanden te homogeniseren.
Houd drosophilavoorraden aan op een standaard maïsmeel (9%), gist (10%) en agar medium (1,5%) aangevuld met antibioticum (0,4% methylpara-hydroxy-benzoaat) in een licht/donkere cyclus van 12 uur bij 25 °C.
Voer chemosensorische experimenten uit in een temperatuurgecontroleerde ruimte (25 °C) onder ver rood licht (om de bijdrage van visuele signalen te elimineren en om te focussen op chemosensorische signalen). Vernieuw regelmatig de lucht van de ruimte om de ruimte tussen elk experiment te ventileren.

2. Olfactory Response met behulp van een Y-doolhof assay

Verhonger de vliegen gedurende 16-18 uur bij 25 °C in glazen buizen met nat keukenpapier voordat u gaat testen.
Verbind een Y-vormige connector met twee glazen flacons en met een kleinere plastic flacon (laadflacon). Gebruik 1 ml pipettips die door de schuimstoppen gaan om de connector aan de drie flacons te koppelen en om een goed afgesloten Y-doolhof te verkrijgen. Snijd de smalle uiteinden van twee pipetpunten (~ 2 mm diameter, om elke terugkeer van de vlieg te voorkomen zodra deze zijn beslissing heeft genomen) om twee "val"-flacons te vormen, en een groot uiteinde van één pipetpunt om de "laad"-buis te vormen (figuur 1A).
Vlak voor het aansluiten van de "val"-flacons(afbeelding 1B),plaatst u één filterpapier met een diameter van ~ 6 mm in elke flacon. Voeg 40 μl geuroplossing toe op één filterpapier en 40 μl van het overeenkomstige oplosmiddel op het tweede filterpapier.
Introduceer tien vliegen van 4 tot 9 dagen oud in de "ladende" flacon. Gebruik geen CO_2-anesthesie tijdens deze overdracht, omdat het een sterk effect heeft op het gedrag. Gebruik liever korte koeling op ijs. Een goede manipulatie van verdoofde vliegen is belangrijk om de stress op de proefpersonen zoveel mogelijk te beperken.
1. Voer een reeks Y-doolhoftests uit bij 25 °C onder verrood licht (met behulp van LED-lampen om mogelijke verwarmingsbronnen te beperken) om visuele stimuli zoveel mogelijk te vermijden. Zorg ervoor dat u de oriëntaties van de Y-mazen afwisselt (geurige buis aan de linkerkant of aan de rechterkant en laadbuis voor of achter; Figuur 1C).
2. Laat de vliegen enkele uren in de valflacon komen die de geurstof of het oplosmiddel bevat. Count vliegt na 24 uur om de deelname te verhogen tot meer dan 80% en de maximale olfactorische indexwaarde te bieden (Simonnet, persoonlijke communicatie).
3. Bereken de resulterende reukindex met behulp van de volgende formule: (aantal in de geurbuis - getal in de oplosmiddelbuis)/totaal aantal geladen vliegen.
Was de Y-doolhofopstelling als volgt: week de gedemonteerde opstelling 's nachts in de RBS 35 MD. Spoel grondig uit met kraanwater. Spoel ten slotte af met gedeioneerd water en laat uitdrogen.

3. Statistische analyse van de gegevens

Voer een t-test, een eenrichtings-ANOVA of een tweerichtings-ANOVA uit, afhankelijk van gegevens en variabelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

figure-results-1
Figuur 1: Mannelijke reukrespons beoordeeld met een Y-doolhof opstelling. A) Gesplitst apparaat. B) Gemonteerd apparaat. C) Opstelling in werkende staat onder verrood licht. D) Kwantificering van mannelijke reukreacties op azijnzuur (AA) of fenyzijnzuur (PAA) beide verdund in gedestilleerd water (10% v/v) (N = 11, wat een totaal van 110 vliegen vertegenwo...