Dit protocol is een uittreksel uit Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).
1. Lokale hittesondetest
We leveren een schadelijke thermische stimulus aan een individueel larvaal lichaamssegment met behulp van een op maat gemaakte thermische sonde vervaardigd door Pro-Dev Engineering (zie tabel met materialen). Hoewel deze sonde optimale ontwerpkenmerken heeft (een kleine metalen punt van ~ .07 mm2 gebied en de mogelijkheid om een ingestelde punttemperatuur nauwkeurig te handhaven van 23 °C tot 65 °C) moet in principe elk gereedschap met een kleine punt dat kan worden verwarmd tot een gedefinieerde temperatuur gedurende een periode van maximaal 20 seconden volstaan. De sondetip wordt gebruikt om vroege 3rd instar larven precies op de dorsale middellijn bij buiksegment A4 te stimuleren (zie figuur 1). Als reactie op deze thermische stimulus vertonen larven over het algemeen een aversief terugtrekkingsgedrag van lateraal rollen met 360 graden of meer. Dit gedrag onderscheidt zich van hun lichte aanrakingsreactie op een niet-schadelijke metalen sonde op kamertemperatuur, die over het algemeen een korte pauze in hun locomotory-activiteit inhoudt.
Protocol voor de hittesondetest:
- Stel de temperatuur van de thermische sonde vooraf in op het gewenste instelpunt.
- Gebruik een penseel of tang om een individuele larve voorzichtig over te brengen op een plat platform (we gebruiken meestal een klein stukje vinyl gesneden uit een bindmiddel) waarop de larven vervolgens worden gestimuleerd. De larve moet worden bedekt met een dunne waterfilm voordat hij in contact komt met de thermische sonde. De waterfilm die de larve bedekt, moet zo min mogelijk zijn en de larve volledig bedekken, terwijl ervoor wordt gezorgd dat de larve niet droog is bij het aanraken van het vinyl.
- Druk de sondepunt voorzichtig tegen de larve in segment A4 en oefen lichtdruk uit met de punt in een hoek van ongeveer 45° tussen de sonde en het oppervlak van de larve (zie figuur 1). De druk moet een lichte inkeping op het oppervlak van de larve veroorzaken en zal meestal voldoende zijn om voortbeweging te voorkomen. Als de larve blijft bewegen, oefen dan iets meer druk uit en deze stopt meestal. Registreer geen gegevens van larven die zich buiten het gezichtsveld bewegen of waarvoor constant contact met de sonde niet kan worden bereikt tot de reactie of de 20 s cutoff.
- Blijf de larve stimuleren totdat een ontwenningsreactie wordt getoond of totdat de 20 seconden cutoff is bereikt, afhankelijk van wat het eerst optreedt. Reagerende larven vertonen meestal eerst een voorlopig gedrag van het opheffen van het hoofd en de staart. Dit wordt meestal gevolgd door het terugtrekkingsgedrag van het rollen van ten minste 360 graden. Slechts een volledige rol van 360 graden wordt gescoord als nocifensief gedrag (de voorlopige kop- of staartverhoging niet).
- Zodra het opname gedrag is geïnitieerd, geeft u contact met de sonde vrij en registreert u de latentie of tijd tot opname. Als er binnen 20 seconden geen ontwenningsgedrag wordt waargenomen, is de larve een niet-responder. De responders kunnen verder worden onderverdeeld in 2 categorieën. Als het ontwenningsgedrag binnen 5 seconden wordt weergegeven, is de larve een snelle responder. Als het ontwenningsgedrag tussen 5-20 seconden wordt getoond, is de larve een slow-responder (zie figuur 1 in Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).
