Dit protocol is een fragment uit Chiu et al., Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).
1. Het laden van Vliegen in De Buizen van de activiteit en Het Systeem van de Activiteit van de locomotorische Activiteit
- Voordat u vliegen in activiteitsbuizen laadt, schakelt u de incubators in die worden gebruikt om de activiteitsmonitoren te huisvesten. Pas de temperatuur aan met behulp van de incubatorregelaars en stel het licht/donker-regime in met behulp van de DAM System-lichtregelaar OF het eigen lichtregelsysteem van de incubators volgens het gewenste experimentele ontwerp. De tijd die nodig is om vliegen in activiteitsbuizen te laden, moet voldoende zijn om de temperatuur te stabiliseren.
- Verdoof de vliegen met kooldioxide.
- Gebruik een fijn penseel om een enkele vlieg voorzichtig in een activiteitenbuis over te brengen.
- Pak het midden van een enkel stuk garen dat ongeveer een halve inch met fijne tang is en steek het garen in het non-food uiteinde van de activiteitsbuis om de opening aan te sluiten en te voorkomen dat de vlieg ontsnapt tijdens het experiment, terwijl tegelijkertijd luchtstroom in de buis mogelijk is. Als alternatief kunnen plastic doppen met kleine gaatjes (Trikinetics, Inc.) worden gebruikt om de opening te sluiten.
- Zorg ervoor dat de buizen op hun zijkanten worden gelegd totdat de vlieg ontwaakt, anders bestaat het risico dat de vlieg vast komt te zitten aan het voedsel.
- Plaats de buizen in de activiteitenmonitoren. Met het nieuwere, compactere model van de Trikinetics-monitoren (Trikinetics DAM2 en DAM2-7) is het noodzakelijk om de buizen op hun plaats te houden met elastiekjes om ervoor te zorgen dat de infraroodstraal de buis in de middelste positie passeert.
- Plaats de activiteitenmonitoren in de incubators en sluit ze aan op het dataverzamelingssysteem via de telefoondraden. Controleer met behulp van de DAM System-verzamelsoftware of alle monitoren goed zijn aangesloten en dat er gegevens van elk van hen worden verzameld. De monitor zendt infrarood lichtstraal uit over het midden van elke glazen activiteitsbuis. De motorische activiteit van de vliegen wordt geregistreerd als ruwe binaire gegevens waarbij "één" wordt geregistreerd telkens wanneer de infrarode straal wordt gebroken of een "nul" wordt geregistreerd waarin de infrarode straal niet wordt gebroken.
2. Experimenteel ontwerp om gegevens vast te leggen voor bepaling van circadiane periodiciteit en amplitude
- Vliegen worden gesynchroniseerd en getraind door ze gedurende 2-5 volle dagen bloot te stellen aan het gewenste licht/donker (LD) en temperatuurregime. De meest gebruikte entrainment conditie is een licht/donker cyclus van 12 uur licht/ 12 uur donker (12:12 LD) bij 25 °C. Deze algemeen aanvaarde standaardvoorwaarde is in wezen gebaseerd op de gedachte dat Drosophila afkomstig is van Afro-equatoriale locaties. Bij het bestuderen van circadiaanse ritmes is er een bepaalde fraseologie die men moet leren kennen. Relevant voor dit protocol is dat de tijd dat de lichten in de incubator branden, wordt gedefinieerd als tijdstijd 0 (ZT0) en alle andere tijden zijn relatief ten opzichte van die waarde (bijv. in een LD-cyclus van 12:12 is ZT12 het tijdstip waarop de lichten worden uitgeschakeld). Onder standaard 12:12 LD-omstandigheden vertonen wilde type Drosophila melanogaster meestal twee aanvallen van activiteit; een gecentreerd rond ZT0 genoemd "ochtend" piek en een andere rond ZT12 genoemd "avond" piek (Figuur 1A). De ochtend- en avondperiodes worden gecontroleerd door de endogene klok, maar er zijn ook "schrikreacties" die voorbijgaande uitbarstingen van activiteit zijn als reactie op de licht / donkere overgangen. Twee dagen entrainment is het minimum en kan bijvoorbeeld worden gebruikt in grote schermen die tijdrovender zijn en gericht zijn op het meten van vrije periodes in constante duisternis (zie hieronder, stap 2). Als u echter geïnteresseerd bent in het bestuderen van de activiteitspatronen tijdens een dagelijkse licht-donkercyclus, verdient het de voorkeur om de vliegen 4-5 dagen in LD te houden om meer gegevens te verkrijgen. In wezen zal het verhogen van het aantal vliegen of het aantal LD-dagen in de eindgegevensanalyse (bijv. poolgegevens van de laatste twee dagen van LD-motorische activiteit) betrouwbaardere dagactiviteitsprofielen en metingen genereren (bijv. timing van ochtend- of avondspits). Bovendien varieert de dagelijkse verdeling van de activiteit afhankelijk van de daglengte (fotoperiode) en temperatuur. Een belangrijke reden voor het veranderen van de fotoperiode of temperatuur ten opzichte van de standaard is als men wilde bestuderen hoe dagelijkse activiteitspatronen seizoensgebonden aanpassing ondergaan (bijv. Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila kan ook worden ingetraind voor dagelijkse temperatuurcycli (bijv. Glaser en Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). Temperatuurcycli die variëren met slechts 2-3 °C zijn voldoende om activiteitsritmes te trainen.
- Vrijlopende bewegingsritmes worden gemeten onder constante donkere en temperatuuromstandigheden nadat de entrainingsperiode is voltooid (zie hierboven, stap 1). De instelling voor de lichtcyclus kan op elk moment in de donkere fase op de laatste dag van LD worden gewijzigd, zodat de volgende dag van het experiment de eerste dag van DD vertegenwoordigt. Zeven dagen DD-gegevensverzameling is voldoende om de circadiane periode en amplitude (bijv. kracht of kracht van ritme) van vliegen te berekenen. Over het algemeen is een steekproefgrootte van ten minste 16 vliegen nodig om betrouwbare vrijeloopperioden voor een bepaald genotype te verkrijgen. Zelfs als men alleen geïnteresseerd is in het meten van dagactiviteit, is het nog steeds het beste om de vrije loopperioden van de vliegen in DD te meten, omdat veranderingen in endogene periode de dagelijkse verdeling van activiteit in LD kunnen veranderen. Vliegen met lange endogene perioden vertonen bijvoorbeeld meestal vertraagde avondpieken in LD (zie bijvoorbeeld figuur 2).
- Aan het einde van het experiment worden ruwe binaire gegevens die zijn verzameld met behulp van de DAM System-software gedownload naar een draagbaar gegevensopslagapparaat, bijvoorbeeld een USB-sleutel.
- De ruwe binaire gegevens worden verwerkt met behulp van DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) en samengevat in bakken van 15 en 30 minuten bij het analyseren van circadiane parameters, of 1 tot 5 minuten opslaglocaties bij het analyseren van slaap-/rustparameters. Momenteel is vijf aaneengesloten minuten van inactiviteit de standaarddefinitie van slaap/rust in Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho en Sehgal, Methods Enzymol., (2005)).
- Er zijn veel verschillende manieren om de verzamelde gegevens op het DAM-systeem te analyseren, maar we zullen alleen die methoden bieden die routinematig in ons lab worden gebruikt. Microsoft Excel wordt gebruikt om genotype toe te wijzen aan verschillende voorbeeldgroepen. FaasX software (M. Boudinot en F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Frankrijk) of Insomniac (Matlab-gebaseerd programma; Leslie Ashmore, Universiteit van Pittsburgh, PA) worden gebruikt om circadiane (bijv. periode en macht) of slaap / rust (bijv. percentage slaap, gemiddelde rust bout lengte) parameters respectievelijk te onderzoeken.
