$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dit protocol is een fragment uit de Vries en Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013).
1. Genereer Channelrhodopsin-vliegen
- Cross UAS-ChR2 vliegt met de Gal4 driver van uw keuze, we gebruiken G105-Gal4, die wordt uitgedrukt in Foma-1 neuronen in de optische kwab.
- Om de mogelijkheid van een visuele reactie op de blauwlichtstimulatie te elimineren, bevinden beide vlieglijnen zich op een w+norpA-achtergrond.
- Eindresultaat: w+norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Nadat volwassen vliegen eclose, zet geselecteerde vrouwtjes op vers voedsel, aangevuld met 10 μM all-trans-retinal (een co-factor vereist voor ChR2) en beschermd tegen licht, gedurende 3 dagen voor het uitvoeren van de gedragstest.
2. Maak 10 μM all-trans-retinale verbeterde voeding
- Los 100 mg all-trans-retinal op in 17,6 ml 95% ethanol om 20 mM netvlies te maken. Houd all-trans-retinale te allen tijde beschermd tegen licht.
- Smelt standaard maïsmeelvliegvoedsel in de magnetron en laat afkoelen tot het warm is om aan te raken.
- Meng 50 μl 20 mM all-trans-retinal in flacons van 10 ml vliegvoer.
- Laat de flacons afkoelen en bescherm ze tegen licht.
3. Uitrusting
- Pipettips: Standaard 1.000 μl pipetpunten worden in de buurt van de punt gesneden, waardoor een poriediameter van ~ 2,25 mm ontstaat.
- platform (zie figuur 1).
- Een Delrin-basis, 17 cm X 25 cm, werd gebouwd met schroefdraadgaten op elke hoek om 1/4" NPT koelvloeistofslangaansluitingen te passen.
- Een verticale houder, gemaakt van Delrin, is bevestigd aan het midden van de basis. De totale afmetingen zijn 25 mm X 40 mm X 65 mm (breedte X diepte X hoogte). Een 10 mm brede groef loopt over de lengte van de houder, met een duimschroef aan de onderkant. Aan de bovenkant van de houder is een platform bevestigd, 25 mm X 40 mm X 10 mm, met een gat met een diameter van 3,5 mm uitgelijnd met de groef in de houder.
- LED-arrays (zie figuur 1).
- Vier armen van koelvloeistofslang, ~18 cm lang, worden met behulp van de koelvloeistofslangconnector op de platformbasis bevestigd. Koelvloeistofslang wordt alleen gebruikt als structurele ondersteuning en wordt niet gebruikt voor koeldoeleinden.
- Goed gespreide groeven worden in het laatste stuk koelmiddel van elke arm gesneden om een koellichaam aan het uiteinde van elke arm aan te brengen.
- Op elk koellichaam is een blauwe LED Rebel Tri-Stars gemonteerd met behulp van voorgesneden thermische plakband. Op elke Tri-Star wordt een Carclo 18° Tri-lens aangebracht.
- LED Tri-Stars zijn aangesloten op de BuckPuck DC drivers en een voeding zoals gespecificeerd. We hebben onze set-up geregeld met elke BuckPuck die twee Tri-Stars in serie aandrijft.
- Verlichting van alle vier LED Tri-Stars op 700 mA leverde een bestraling van 713 W/m2 op ons platform op.
- Camera: De camera is gemonteerd op een klein statief en gericht op de bovenkant van het platform.
4. Gedragstest
- Verdoof vliegen kort op ijs.
- Plaats individuele vliegen in pipetpunten, gebruik tape om beide uiteinden van de punt te sluiten.
- Nadat de vliegen zijn ontwaakt en actief de pipetpunt verkennen, verwijdert u de tape en plaatst u een pipet in de groef in een verticale houder. De duimschroef wordt gebruikt om de pipettip op zijn plaats te houden en de onderkant van de punt te sluiten.
- Terwijl de vlieg de pipettip verkent (meestal 30 - 60 sec), start u de camera-opname net voordat de vlieg uit de punt op het platform komt.
- Nadat de vlieg op het platform is verschenen, wacht u 1-2 seconden en schakelt u de blauwe LED's in. Gebruik een timer om handmatig de tijd te meten totdat de vlieg de vlucht initieert.
