$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dit protocol is een uittreksel uit Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).
1. Kamerbouw, Assemblage, Assay Setup
- Laat een machinewerkplaats acryl eierlegkamers bouwen(figuur 1A-D). De technische tekening van verschillende stukken werd weergegeven in aanvullende figuur 1-3. Hoge resolutie foto's zijn ook hier te vinden(http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Plaats plastic platen in het laadstuk (boven) van de kamer, zoals aangegeven in figuur 1C. Dit dient als het onderste oppervlak tijdens het laden van vliegen in individuele eierleggende arena's.
- Verdoof vrouwtjes op een CO2-pad en laad ze individueel in elke arena voor het leggen van eieren. Laat ~30 min voor vliegen om te herstellen van de CO2 en om te wennen aan de nieuwe omgeving.
- Bereid de agarose substraten voor.
- Bewaar voor het gemak een vooraf gemaakte fles gesmolten 1% agarose in een waterbad van 55 °C.
- Voeg de gewenste hoeveelheid bouillonsucroseoplossing (2 M) toe aan een conische buis van 50 ml en meng deze met de juiste hoeveelheid agarose. Om bijvoorbeeld het 150 mM sucrosesubstraat voor te bereiden, plaatst u 750 μl 2 M sucrose-oplossing in de buis en vult u de buis vervolgens met agarose tot de 10 ml-markering.
- Bereid het gewone substraat op dezelfde manier, maar voeg gedestilleerd water toe in plaats van sacharose-oplossing.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van agarose in dit protocol is iets minder dan 1%. Onze ervaring is dat de exacte concentratie van agarose er niet toe doet zolang het wordt gecontroleerd om binnen ~ 0,9 - 1,1% te zijn en dat de twee substraten van dezelfde agaroseconcentratie zijn.
- Neem het substraat (onderste) stuk van de kamer en pipet 1.000 μl agarosesubstraat in elke trog zoals te zien in figuur 1D.
- Laat agarose ~30 min stollen.
- Zodra de agarose substraten en vliegen klaar zijn, monteert u alle drie de stukken van de eierlegkamer en haalt u vervolgens de plastic vellen eruit.
- Plaats de kamers in vliegincubatoren.
OPMERKING: De duur van het leggen van eieren kan variëren, afhankelijk van de experimentele behoeften. We voeren meestal het experiment O/N uit (14 - 16 uur). Ook werd geen significante impact van circadiane timing op de voorkeuren voor het leggen van eieren waargenomen.
- Verdoof vrouwtjes door CO2 in de kamer te injecteren. Demonteer de kamer, gooi de verdoofde vliegen weg in het mortuarium van de vlieg(d.w.z.een lege koffiekan gevuld met wat maïsolie). Maak foto's van de resultaten voor de registratie (zie figuur 2).
- Tel het aantal eieren handmatig en bereken voorkeursindexen voor analyse. Bereken de voorkeursindex als (Na - Nb)/(Na + Nb) waarbij Na en Nb respectievelijk het aantal eieren op locatie a versus plaats b vertegenwoordigen.
