$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Het volgende protocol is een uittreksel uit Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp. (2018).
1. Voorkomen van nakomelingenproductie door toevoeging van 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
- Kweek dieren tot het L4-stadium bij 20 °C. Controleer of gesynchroniseerde dieren zich ongeveer 40 uur na het zaaien tot L4 hebben ontwikkeld (stap 2.1.7).
OPMERKING: De ontwikkelingstijd van C. elegans zal variëren bij verschillende temperaturen en groeisnelheden van gemuteerde dieren waarvoor de percentages niet zijn gekarakteriseerd, moeten empirisch worden getest.
- Voeg 160 μL 50x FUdR toe aan elke plaat van 6 cm met L4-dieren.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om FUdR toe te voegen in de L4-fase. Maak voor het gemak 1.000 x voorraden FUdR door 1 g FUdR op te lossen in 10 ml ultrapure H2O. Filtersterilisatievoorraad FUdR met een filter van 0,2 μm en een spuit van 10 cc. Aliquot ~1 ml voorraad in steriele buizen van 1,5 ml. Invriezen en bewaren bij -20 °C.
- Inspecteer platen op de aanwezigheid van mannelijke C. elegans. Verwijder alle mannetjes.
OPMERKING: Levensduur wordt meestal gemeten voor hermafrodieten en niet voor mannen. Hermafrodieten die paren leven korter dan ongematte dieren, zelfs in aanwezigheid van FUdR. Mannetjes zijn kleiner en dunner dan hermafrodieten en zijn gemakkelijk te herkennen aan een kenmerkende gehaakte staart.
- Doe de doos terug in de ritssluitingszak. Keer terug naar 20 °C incubator.
2. Levensvatbaarheid scoren
- Scoor dagelijks de levensvatbaarheid door het dier voorzichtig op het hoofd aan te raken met een platinadraad of wimper. Scoor dieren die niet als dood bewegen en verwijder ze van de plaat (Figuur 1A). Noteer het aantal waargenomen doden voor elke voorwaarde voor elk observatietijdpunt.
OPMERKING: Om het risico op scoringsbias te verminderen, moet de experimenteerder blind blijven voor experimentele omstandigheden en mag hij tijdens het scoren niet verwijzen naar de resultaten van eerdere tijdspunten.
- Censuur dieren die scheuren, sterven aan andere duidelijke ontwikkelingsstoornissen of aan de zijkant van de schaal kruipen: verwijder deze dieren en noteer het aantal op elk waargenomen tijdstip ter overweging in de statistische analyse. Bovendien, als mannetjes worden gevonden, verwijder ze en noteer het waargenomen aantal.
- Herhaal dit dagelijks vanaf stap 2.1 totdat er geen dieren in leven blijven.
OPMERKING: Als het gazon van E. coli aanzienlijk afneemt of schimmel op de plaat begint te groeien, breng dan alle resterende dieren over op een verse plaat met de juiste RNAi en FUdR.
